成肌细胞分化实质是由一些正向调控因子和负向调控因子双向调节的过程。胰岛素样生长因子 (I GFs)和生肌调节因子(myogenic regulatory factor, MRFs)家族在成肌细胞的增殖和分化过程中起正向调控作用。IGFs 在次级纤维的形成过程中分子表达量增加,刺激成肌细胞增殖,维持肌纤维的分化。MRFs 家族包括 4 个成员: MyoD、肌细胞生长素(MyoG)、生肌因子 5(Myf5)、生肌因子 6(Myf6 或MRF4)侧翻手机。 它们能激活肌肉特定基因, 通过调控肌动蛋白(actin)基因发挥作用。其中 Myf5 和 MyoD 在增殖的肌母细胞表达, MyoG 在分化的和成熟的肌细胞表达, Myf6在成年哺乳动物肌肉组织中持续表达[26]。肌生成抑制素(MSTN, Myostatin, 又称GDF-8), 属于转化生长因子β 超家族, 是近年来发现的一类肌细胞分化负调控因子, 它通过抑制MyoD家族成员转录活性负向调控肌细胞的生长发育和分化。 氧化还原状态影响基因转录、细胞迁移、增殖、凋亡与DNA修复等[12]
。Sirt1 作为氧化还原态的潜在传感器来调控骨骼肌细胞的分化[12]。它在成肌细胞中表达, 当细胞进入终末分化期, 它的表达量下降。Marcella F等[ 12]
利用染质免疫沉淀实验证明Sirt1结合于骨骼肌分化基因的启动子上, 诱导组蛋白H3残基K9 和K14 去乙酰化。基因组微阵列分析表明超表达Sirt1 可以特异性抑制肌细胞分化标志基因,
如MyoD, Myf5[12]。骨骼肌细胞中[NAD+]/[NADH]的比率发生着动态变化, 在终末分化的肌细胞中, [NAD+]/[NADH]的比率下降。NAD+的氧化形式调节Sirt1 ahrp的酶活性。胞质中[NAD+]/[NADH]的比率以Sirt1 依赖型方式影响肌肉基因的表达。Sirt1 能潜在
地诱导MEF2 脱乙酰基, 它并不直接与MyoD和MEF2 相互作用, 而是通过PCAF/GCN5 乙酰转移酶介导使PCAF和MyoD脱乙酰基, 来抑制MyoD和
MEF2 的表达。用烟酰胺处理超表达Sirt1 的肌细胞, 发现肌细胞又重新开始表达其标志基因, 并进行分 化[12]。体内实验证明降低内源Sirt1 导致肌细胞标志基因表达增加, 促进肌细胞分化。研究证实, Sirt1 也可有效抑制人类的原代骨骼肌细胞分化为多核肌细胞[12]。本实验室研究结果已初步证实Sirt1 抑制猪成肌细胞向肌细胞分化分子动力学仿真(数据正在整理中, 尚未发表)。
成肌细胞分化除了以上影响因素外, 还受其他蛋白因子的影响。Grazia C等[27]研究表明, 用基因敲除技术敲除成肌细胞中的pRb (retinoblastoma protein)基因, 成肌细胞分化被抑制, 但该研究没有证实pRb与生肌调节因子和肌生成抑制素之间的关系。总之, 成肌细胞分化的机制非常复杂, 研究Sirt1 对生肌调节因子和肌生成抑制素表达的作用, 有助于进一步了
解成肌细胞分化的机制。
McPherronA.C(1997)首次发现骨骼肌生长分化因子8(GroWtl1月。lfferentiationFactor，GDF一8)，该基因即肌肉抑制素基因伽yostati几MsTN)，亦简称为抑肌素基因。基因敲除培育的无GDF一8转基因鼠骨骼肌重量比正常小鼠重20(卜300%，纯合体小鼠可正常生殖，其它组织和器官均正常，这个实验结果一经发表，便引起了科学界的高度重视。
Myostatin基因在家畜家禽中普遍存在，通过对
胚胎千细胞敲除该基因的“巨型鼠”以及双肌臀良种牛的存在，有力地说明了即使在大型经济动物中这种基因工程操作也有获得成功的可能，这就为家畜、家禽改良研究工作提供了新的途径和思路，还可以应用基因工程方法生产GDF8基因活性蛋白，减少对骨骼肌生长的抑制，改善肉适口性及产肉性能。对GDF一8基因和抑制GDF一8传递信号分子的研究有助于肌变性疾病如肌肉营养不良、肌肉萎缩症、神经肌肉疾病和癌衰弱等的研究。
从候选的大范围基因组区-域内将特定的表边字列筛选出来，是一项艰苦的系统工程。获取覆盖候选区域表达序列所对应的cDNA片段方法很多，主要有:(l)zo。blots傲Monac0A只eta
l.1986;R。~ensJM，etal.1989):根据物种间编码区序列的同源性大大高于非编区的特点，用某物种己知的基因的cDNA作探针，在其它物种中进行(cDNA文库的)杂交筛选，可快速地在其它物种中筛选出与探针同源的新基因。(2)叨islands法(Lindsav，S.，etal.r987;pontarotti尹，et日.1985)。(3)。DNA直选法让。vett，M.，etal.l卯l尹面moo，5.，eta一1958):将基因组DNA(如
YACDNA)吸附于生物磁珠或固定在滤膜等支持物上，然后与cDNA文库的PCR扩增产物杂交，在较严格的洗脱条件下将非特异性吸附的cDNA洗去后，再洗脱卜特异性杂交的cDNA，去进行第二轮套式PCR扩增，然后将扩增产物克隆进合适的载体中，即得到该基因的cDNA序列。(4)噬菌斑杂交筛选法(ElvinP，P.，etal.1990)，方法是直接用基因组DNA片段作探针杂交筛选cDNA文库。Alexandra.A.C.等(1997)也采用该法筛选得到GDF一8阳性。DNA克隆，进一步分析得以证实。(5)外显子捕获法(exontrappin目是Ruekler，A.J.等(1991)提出的一种方法。(6)咒R扩增法。(7)体细胞杂交法(somatiecellhybridsXLi认P.，etal.1989)。(8)放射性标记的cD叫A与矩阵排列的基因组DNA克隆进行杂交的方脚Hochgeschwender，u，etal.1989)等等。每种方法在
转化因子p超家族
转化因子p超家族(forminggrowthfactor--p，TGF一p)(sporn，M:Betal.】wan-107986;sPom，MB.，etal.1987)是一类多肤，具有多种功能，如促进和抑制细胞的增殖和生长，介导细胞的损伤和修复等;在调节细胞生长、分化方面有重要作用。研究表明，作为一类重要的生长负调节因子，TGF一p能够抑制多种类型细胞的生长，并将其阻断在G.期(孙红，1998)。现已发现其多达二十多种，它们来源于许多正常细胞和转化细胞，基因结构复杂。Derynck等(1986)首次分离了TGF一p】cDNA克隆，揭开了其神秘面纱，随后陆续克隆出TGF一BZ~TGF一ps的cDNA。I浦光，S.J.等(l990)分离出GDF一1，它与Vg一1拼en叩us)同源性达52%，种间高度保守，GDF一1最有可能是胚胎发育中细胞外介导细胞分化的重要因子。McPherron产.c.等(l997)发现倒悬牵引床GDFbetal一3和GDF一9，cunningham，Ns等(】995)发现了GDF一10，其成熟C端域与BMP一3伽nemorphsisprotein)高度同源，和TGF一p超家族其它成员相比，氨基酸序列同源性最高，达83%，在调节细胞分化，包括骨骼形态发生中起重要作用。至今为止已分离出BMP亚族、加bin亚族、GDF亚族、le御、nodal等，构成了庞大的TGF一p超家族。在B入IP亚族中，DNA核酸序列高度同源，最高达92%，最低74%;在GDF亚族中也如此同源性高达82%。这种同源性具有重要作用，不仅有助于探求其进化历程，更为重要的是有助于寻此家族的其它成员以及进行同源蛋白质结构预测。结构上的保守是基因保守
的表现，TGF一p各成员除了有关氨基酸序列高度保守外，保守性氨基酸残基使用的密码子也高度保守。TGF一p超家族成员都共用一个特征印记，包括一个分泌蛋白前导序列，一个蛋白水解的作用位点和一个含9个C”残基的c末端保守模式。TGF一p超家族各成员的基因结构也相似，它们遍布于整个基因组，长度变化不大，比如GDF一8基因长度的差别主要是由于内含子长度不一致，说明TGF一p超家族在进化上高度保守，可能由同一始祖基因进化而来，TGF-p是在长期的演化史上通过不断的基因重复而形成，古老的重复基因己分布到哺乳动物的整个基因组，而近期的重复基因仍保持着前后相连的顺序。
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