一种细胞可控黏附与释放的方法

1.本发明属于细胞培养组织工程领域，具体涉及细胞培养中细胞的可控黏附与脱附的方法。

背景技术：

2.在细胞培养、组织工程中，细胞的黏附和脱附至关重要，细胞的黏附关系到细胞之后的生长，细胞的脱附关系到细胞培养结束后细胞的获取率。因此，提高细胞的黏附率与脱附率是细胞培养的关键。目前通常使用酶解法将增殖后的细胞从基材上脱附收获，但这种方法会破坏细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的连接蛋白，导致细胞膜蛋白损伤致使细胞功能缺失。并且在实际操作中，胰酶的作用时间也难以控制，作用时间太短，细胞脱附效果不好，作用时间太长，又会使细胞存活率大幅下降。因此非常有必要减少酶解法的使用频次或者选用其它的方法收获细胞。因此有必要提出一种在细胞培养中方便细胞粘附和脱附且不损伤细胞的细胞可控粘附与释放方法。

技术实现要素：

3.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种细胞可控黏附与释放的方法，通过高度生物相容性的氧化还原响应性有序多孔膜的表面润湿性调节，实现细胞培养中细胞的可控黏附与释放，减少细胞损伤。
4.本发明提供的细胞可控黏附与释放的方法，采用氧化还原响应性有序多孔膜进行细胞的培养。本发明采用表面湿润性能够在亲疏水性间可逆转换的智能型有序多孔膜作为细胞培养基材，通过外界刺激因子作用实现细胞在其表面黏附和脱附行为的调控，减少细胞收获时受到损坏。
5.由于细胞黏附对于不同材料表面润湿性的要求不同，亲水的表面利于细胞培养液的浸入、营养交换和细胞膜上亲水部分与培养基底的结合，但疏水的表面又利于细胞膜上受体蛋白的与培养基底的结合，因此太亲水和太疏水的表面都不适宜细胞的黏附。本发明通过调节氧化还原响应性有序多孔膜表面润湿性获得最适宜细胞黏附的多孔膜的表面润湿性。同时，由于所述氧化还原响应性有序多孔膜的表面润湿性具有氧化还原刺激响应性，通过h2o2和vc交替的简单处理可以实现表面润湿性的改变，实现了细胞培养中细胞的可控黏附与可控脱附。此外，所述氧化还原响应性有序多孔膜中引入了含硒化合物，使多孔膜具有高度的生物相容性。在细胞培养时，能够大大提高细胞内trxr酶的活性，提高了细胞的存活率，使细胞存活率从30%提升到了100%。
6.本发明提供的细胞可控黏附与释放的方法，包括以下内容：（1）将氧化还原性有序多孔膜置于质量浓度1～30%的h2o2溶液中进行氧化处理，使氧化还原性有序多孔膜的表面润湿性变亲水，接触角从100
°
变化为60
°
，从而利于细胞的黏附与营养交换，同时也可以起到细胞培养中基底消毒杀菌的作用；（2）将处理后的亲水多孔膜置于孔板或者培养皿中，在多孔膜上接种细胞，加入全
培养基，在孵化箱中培育，使细胞完成黏附与繁殖；（3）全培养基中加入vc(抗坏血酸，加入量为使vc的浓度为200 mg/l），使多孔膜表面变疏水，从而使细胞脱附。
7.上述方法中，进一步地，所述细胞为贴壁细胞。
8.上述方法中，进一步地，步骤（1）中所述h2o2溶液氧化处理的时间最好以使氧化还原性有序多孔膜的接触角为60
°
为准，优选为24 h。
9.上述方法中，进一步地，步骤（1）中1～30% h2o2溶液都能将多孔膜在48 h内氧化成接触角为60
°
的多孔膜，优选使用浓度为30%的双氧水进行处理，以便在氧化处理的同时对多孔膜进行消毒杀菌的处理。
10.上述方法中，进一步地，步骤（3）中加入vc后，等待48 h后，使多孔膜表面变疏水，从而使细胞脱附。
11.上述方法中，进一步地，所述氧化还原响应性有序多孔膜通过以下方法制备得到：(1)将聚合物及氧化还原响应性化合物溶于溶剂中，配制成均匀的溶液；(2)将所配制的溶液滴加到基底表面，并将基底置于匀胶机的旋转平台上；(3)向匀胶机中通入空气，使空气流从溶液正上方吹向溶液，并控制通入的空气速率、匀胶机腔室内部的温度和相对湿度，同时启动匀胶机并控制其转速；(4)待溶剂全部挥发后，停止匀胶机转动，取出基底即得到有序多孔膜材料。
12.上述多孔膜的制备方法中，所述聚合物为聚乳酸、聚苯乙烯中的至少一种，优选为聚苯乙烯。
13.上述多孔膜的制备方法中，所述氧化还原响应性化合物为烷基硒醚，其结构通式为r
1-se-r2，其中r1和r2为c8～c
20
的烷基，r1和r2可相同可不同；优选为r1＝r2＝c
12h25
，即优选正十二烷基硒醚。
14.上述多孔膜的制备方法中，所述溶剂为二氯甲烷、、二硫化碳中的至少一种，优选为。
15.上述多孔膜的制备方法中，所述基底为玻璃、硅片或聚酯薄膜，优选为玻璃。
16.上述多孔膜的制备方法中，步骤(1)所得溶液中聚合物浓度为5～50 mg/ml，所述氧化还原响应性化合物浓度为0.01～2 mg/ml；优选地，所得溶液中聚合物浓度为5～30 mg/ml，所述氧化还原响应性化合物浓度为0.01～1.5 mg/ml。
17.上述多孔膜的制备方法中，步骤(3)中通入的空气速率为100～300 l/h，匀胶机腔室内温度为20～28℃，匀胶机腔室内相对湿度为50%～90%，匀胶机的转速为0～50 rpm。
18.本发明还提供了上述氧化还原响应性有序多孔膜在细胞可控粘附和释放中的应用。
19.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果和特点：1.本发明所述方法利用多孔膜的氧化还原响应性，将细胞接种在亲水性的多孔膜表面，实现了细胞的可控黏附，再将多孔膜表面润湿性变成疏水，使细胞膜与培养基底分开，从而实现了细胞的可控脱附。并且所述多孔膜由于引进了含硒化合物，具有优异的生物相容性，无细胞毒性，不仅不会对细胞造成损伤，反而提高的细胞的活性与存活率。
20.2.本发明基于氧化还原响应性的有序多孔膜来进行细胞培养过程中的粘附，并方便脱附，相比现有技术中通过酶解法使细胞脱附的方法，本发明方法中通过低浓度vc就可
以实现细胞的脱附，并且这一过程是高度生物相容的，不会像酶解法那样破坏细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的连接蛋白，导致细胞膜蛋白损伤致使细胞功能缺失。
21.3.本发明方法在利用h2o2溶液（双氧水）调节多孔膜的表面润湿性和亲水性的，实现细胞可控粘附和脱附的同时，对细胞培养的的基底也起到消毒杀菌的作用，保证了细胞培养的安全性，无菌性。本发明解决了传统消毒方法，如高温、高压、紫外线、h2o2溶液消毒灭菌等手段对培养基底造成不可逆的化学结构影响的问题，解决了消毒难题。
附图说明
22.图1为实施例1制备的氧化还原有序多孔膜的扫描电镜图片；图2为经h2o2溶液氧化处理的多孔膜表面的细胞粘附情况（a），以及经vc处理后多孔膜表面的细胞脱附情况。
23.图3为细胞脱附黏附过程中的相对细胞活性；图4为对比例3和对比例4中多孔膜表面的细胞粘附情况。
具体实施方式
24.下面通过实施例对本发明做进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
25.以下实施例中正十二烷基硒醚参照文献angew.chem.2014,126,11694-11697.controlofsilver(i)-dialkylchalcogenidecoordinationbyasyntheticcavity中公开的方法。其他物料均可于市场购买。
26.实施例1制备氧化还原响应性有序多孔膜（1）将聚苯乙烯和正十二烷基硒醚溶于中，配制聚苯乙烯和正十二烷基硒醚浓度分别为10mg/ml和1.2mg/ml的溶液；（2）取40μl上述溶液滴加到玻璃基底上，并放置到匀胶机的旋转平台上；（3）以200l/h的速率通入空气，并控制匀胶机腔室内部温度为25oc，相对温度为70%，同时启动匀胶机并控制转速为20rpm。
27.（4）约2min后溶剂全部挥发，停止匀胶机转动，取出基底得到有序多孔膜。
28.扫描电子显微镜观察如图1所示，可见该多孔膜表面高度规整有序，呈六方排列，该多孔膜的表面结构微孔直径约为5μm。
29.对比例1制备无氧化还原响应性有序多孔膜（1）将聚苯乙烯溶于中，配制聚苯乙烯浓度为10mg/ml的溶液；（2）取40μl上述溶液滴加到玻璃基底上，并放置到匀胶机的旋转平台上；（3）以200l/h的速率通入空气，并控制匀胶机腔室内部温度为25oc，相对温度为70%，同时启动匀胶机并控制转速为20rpm。
30.（4）约2min后溶剂全部挥发，停止匀胶机转动，取出基底得到有序多孔膜。
31.以下实施例说明制备的多孔膜表面润湿性的氧化还原响应性能对实施例1中的制备的多孔膜会进行水滴接触角测试。水滴接触角测试表明，该多孔膜的初始接触角为100
°
，表明该多孔膜为疏水性。将多孔膜放入质量浓度30%的h2o2水溶
液中氧化24 h，在室温下待其自然干燥后，测试其接触角。结果表明，在氧化24 h后，接触角降低至60
°
。之后再将多孔膜放入200 mg/l vc水溶液中还原24 h，在室温下待其自然干燥后，测试其接触角。结果表明，在还原24 h后，接触角回复至90
°
左右。说明多孔膜的多孔膜表面润湿性具有氧化还原响应性能，并且响应程度较大，可以从疏水变亲水再变疏水。
32.对对比例1中的制备的多孔膜会进行水滴接触角测试。水滴接触角测试表明，该多孔膜的初始接触角为100
°
，表明该多孔膜为疏水性。将多孔膜放入质量浓度30%的h2o2水溶液中氧化24 h，在室温下待其自然干燥后，测试其接触角。结果表明，在氧化24 h后，接触角无变化。之后再将多孔膜放入200mg/l vc水溶液中还原24 h，在室温下待其自然干燥后，测试其接触角。结果表明，在还原24 h后，没有变化，说明多孔膜的多孔膜表面润湿性不具有氧化还原响应性能，并且稳定。
33.以下实施例说明多孔膜的生物相容性按国标gb/t 16886.5-2017 《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》进行对对比例1中多孔膜进行细胞毒性实验，细胞毒性实验结果为3级，即具有中毒细胞毒性。
34.按国标gb/t 16886.5-2017 《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》进行对实施例1中多孔膜进行细胞毒性实验，细胞毒性实验结果为0级，即无细胞毒性，说明该种多孔膜具有优异的生物相容性。
35.按国标gb/t 16886.5-2017 《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》进行对实施例2中氧化处理后的多孔膜进行细胞毒性实验，细胞毒性实验结果为0级，即无细胞毒性，说明该种多孔膜具有优异的生物相容性。
36.将对比例1、实施例1、实施例2中的多孔膜置于细胞培养液中，在细胞培养过程中按照测细胞内trxr酶的活性，测得实施例1、实施例2的活性相同，且为对比例1的3倍，说明本发明制备的多孔膜可以大大提高细胞内trxr酶的活性。
37.以下实施例说明通过实施例1制备的多孔膜实现细胞可控黏附与释放的方法实施例2（1）将实施例1制备的氧化还原性有序多孔膜置于质量浓度30%的h2o2溶液中进行氧化处理24h，使氧化还原性有序多孔膜的表面润湿性和清亲水性提高，接触角为60
°
，从而利于细胞的黏附与营养交换，同时也可以起到细胞培养中基底消毒杀菌的作用；（2）接种细胞为nih3t3，细胞量约为1
×
104，将其接种在多孔膜表面，培养在有300 μl全培养基的6孔板中；在5% co2，37℃的孵化箱中培育48小时，此时细胞完成黏附与增殖。
38.（3）加入vc进入全培养基中，使其浓度为200 mg/l，然后使用300 μl全培养基给细胞换液。在5% co2，37℃的孵化箱中培育48小时。
39.按照相同方法培养细胞，仅不加vc，使用原先的全培养基给细胞换液，作为空白对照。
40.通过cck-8法和calcein-am的方法对多孔膜的黏附率进行表征。结果如图2图3所示。在5% co2，37℃的孵化箱中培育48小时后，细胞黏附在亲水的多孔膜表面并且增殖，见图2a；使用vc脱附以后，脱附率可以达到90%以上，见图2b。从图3可见，在5% co2，37℃的孵化箱中培育48小时后，细胞黏附和存活率较高，在vc脱附以后，基本全部脱附，而空白对照细胞未能脱附。
41.对比例3接种细胞为nih3t3，细胞量约为1
×
104，将其接种在对比例1中的疏水多孔膜表面，培养在有300 μl全培养基的6孔板中，在5% co2，37℃的孵化箱中培育48小时。之后加入vc进入全培养基中，使其浓度为200 mg/l，然后使用300 μl全培养基给细胞换液。
42.按照相同方法培养细胞，仅不加vc，使用原先的全培养基给细胞换液，作为空白对照。
43.通过cck-8法和calcein-am的方法对多孔膜上细胞的黏附结果进行表征。在5% co2，37℃的孵化箱中培育48小时后，细胞粘附结果如图4a所示，可见疏水的多孔膜表面几乎不黏附细胞。从图3可见，在5% co2，37℃的孵化箱中培育48小时后，无论是否加入vc，细胞皆无黏附情况。
44.对比例4接种细胞为nih3t3，细胞量约为1
×
104，将其接种在实施例1中的疏水多孔膜表面，培养在有300 μl全培养基的6孔板中，在5% co2，37℃的孵化箱中培育48小时。之后加入vc进入全培养基中，使其浓度为200 mg/l，然后使用300 μl全培养基给细胞换液。
45.按照相同方法培养细胞，仅同不加vc，使用原先的全培养基给细胞换液，作为空白对照。
46.通过cck-8法和calcein-am的方法对多孔膜上细胞的黏附结果进行表征。在5% co2，37℃的孵化箱中培育48小时后，细胞粘附结果如图4b所示，可见疏水的多孔膜表面几乎不黏附细胞。从图3可见，在5% co2，37℃的孵化箱中培育48小时后，无论是否加入vc，细胞皆无黏附情况。
47.可见，通过双氧水和vc处理，实现了细胞的可控黏附与可控脱附。在细胞培养的初期，通过双氧水使多孔膜表面变亲水，就可以使细胞黏附，如不处理，细胞无法黏附生长，说明细胞的粘附可控。在细胞黏附完成后，通过加vc的使细胞脱附，不加vc细胞则会继续黏附在多孔膜上，这说明细胞脱附的过程也是可控的。

技术特征：

1.一种细胞可控黏附与释放的方法，其特征在于，采用氧化还原响应性有序多孔膜进行细胞的培养，包括以下内容：（1）将氧化还原性有序多孔膜置于质量浓度1～30%的h2o2溶液中进行氧化处理，使氧化还原性有序多孔膜的表面润湿性变亲水，接触角从100
°ꢀ
变化为60
°
，从而利于细胞的黏附与营养交换，同时也可以起到细胞培养中基底消毒杀菌的作用；（2）将处理后的亲水多孔膜置于孔板或者培养皿中，在多孔膜上接种细胞，加入全培养基，在孵化箱中培育，使细胞完成黏附与繁殖；（3）全培养基中加入vc(抗坏血酸，加入量为使vc的浓度为200 mg/l），使多孔膜表面变疏水，从而使细胞脱附。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述细胞为贴壁细胞。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（1）中所述h2o2溶液氧化处理的时间以使氧化还原性有序多孔膜的接触角为60
°
为准。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（1）使用浓度为30%的双氧水进行处理。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述氧化还原响应性有序多孔膜通过以下方法制备得到：(1)将聚合物及氧化还原响应性化合物溶于溶剂中，配制成均匀的溶液；(2)将所配制的溶液滴加到基底表面，并将基底置于匀胶机的旋转平台上；(3)向匀胶机中通入空气，使空气流从溶液正上方吹向溶液，并控制通入的空气速率、匀胶机腔室内部的温度和相对湿度，同时启动匀胶机并控制其转速；(4)待溶剂全部挥发后，停止匀胶机转动，取出基底即得到有序多孔膜材料。6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述聚合物为聚乳酸、聚苯乙烯中的至少一种。7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述氧化还原响应性化合物为烷基硒醚，其结构通式为r
1-se-r2，其中r1和r2为c8～c
20
的烷基，r1和r2可相同可不同。8.氧化还原响应性有序多孔膜在细胞可控粘附和释放中的应用。9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，在使用1～30%的h2o2溶液对氧化还原响应性有序多孔膜氧化处理后，在多孔膜上接种细胞，加入全培养基进行培养，使细胞完成黏附与繁殖；培养后加入vc使细胞脱附。

技术总结

本发明公开了一种细胞可控黏附与释放的方法，采用表面湿润性能够在亲疏水性间可逆转换的智能型有序多孔膜作为细胞培养基材，由于所述氧化还原响应性有序多孔膜的表面润湿性具有氧化还原刺激响应性，通过H2O2和VC交替的简单处理可以实现表面润湿性的改变，实现了细胞培养中细胞的可控黏附与可控脱附。此外，所述氧化还原响应性有序多孔膜中引入了含硒化合物，使多孔膜具有高度的生物相容性。本发明方法能够实现细胞培养中细胞的可控黏附与释放，减少细胞损伤。减少细胞损伤。减少细胞损伤。