1、实验目的
利用月季幼苗叶片作为实验材料，通过提取其基因组DNA，并设计特定引物，利用PCR体外扩增技术对月季基因PK2A的基因片段进行体外扩增。随后，通过琼脂糖凝胶电泳、凝胶回收和一系列分子生物学技术完成PK2A基因的克隆，随后通过转化把其重组载体转化进大肠杆菌中并完成鉴定。通过该综合实验达到能够让学生系统和熟练掌握如何利用分子生物技术克隆外源基因并掌握重组载体转化和鉴定技术，为进一步进行基因工程操作做好能力训练。 2、实验材料
材料：月季幼苗或者幼嫩叶片，大肠杆菌感受态细胞
器材：研钵，恒温水浴，离心机，离心管，PCR仪、生化培养箱、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统，去离子水、超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，酒精灯等。
3、实验原理
通过配制DNA提取液，利用研磨法获得DNA模板，然后采用PCR技术扩增PK2A
基因获得目的片段完成对其基因的体外克隆，并通过凝胶回收获得目的基因片段。大肠杆菌感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42℃短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能，并通过氨苄抗性筛选获得重组子，同时结合菌落PCR技术进一步验证外源重组载体是否成功转化。 4、实验试剂、方法和步骤
4.1、试剂配制
（1）50×TAE（pH8.5）：称下列试剂，置于1L烧杯中：Tris 242g；Na2EDTA.2H2O 37.2 g；加入800ml去离子水，搅拌溶解。加57.1ml醋酸，充分搅拌。加去离子水定容至1L。
（2）LB液体培养基：蛋白胨1g；酵母粉0.5g；NaCl 0.5 g 加H2O定容至100ml，高压灭菌后密封备用。
（3）LB固体培养基：蛋白胨1g；酵母粉0.5g；NaCl 0.5 g；Agar 1.5g。加H2O定容至100ml，高压灭菌后于超净台铺平板。
（4）100 mg/ml Ampicillin（氨苄）和卡那霉素：称取药品直接加入无菌水，制为母液。（使用时稀释至所需浓度）。
（5）24 mg/ml IPTG：称取药品直接加入无菌水，制为母液。（使用时稀释至所需浓度）。
（6）2M NaOH：4g NaOH 加入50ml H2O。
（7）10% SDS：称10g SDS加热溶于约80ml水中。加浓盐酸调pH至7.2后定容至100ml。木纹扣板
（8）6×loading Buffer: 称0.88g EDTA，50mg溴酚蓝，50mg二甲苯腈蓝FF，溶于约40ml水中，加36ml甘油后，用2M NaOH调pH至7.0，加水定容至100ml。
（9）100 mM EDTA（pH8.0）：称取18.61g EDTA溶于约80mL 的ddH2O中，用NaOH 溶液调pH值至8.0后定容至100mL，高压灭菌备用。
（10）1M Tris-HCl（pH8.0）：称取12.114g Tris 溶于约80mL 的ddH2O 中，用盐酸调pH值至8.0，然后定容至100mL，高压灭菌备用。
（11）DNA抽提缓冲液：1M Tris-HCl（pH8.0）1.0mL、100mM EDTA（pH8.0 0.1mL、10% SDS 0.1mL ；10mg/mL RNaseA酶液0.2mL 混合后再用ddH2O 定容至100mL即可。
（12）实验所需试剂或试剂盒：质粒提取试剂盒；DNA片段回收试剂盒等
4.2、实验方法和步骤
4.1.1总RNA抽提
（1）高压灭菌及DEPC处理ddH2O、洗净的研钵研棒和相关的提取所用材料，彻底灭活里面的RNA酶。提RNA的整个过程必须带上干净的医用口罩及帽子，并且整个操作过程所使用的头都必须保证没有RNA酶的污染。
（2）将处理过的研钵棒、研钵及小勺先用酒精烧几分钟，再用液氮预冷，剪取新鲜幼嫩的植物组织放于研钵加入液氮彻底冷冻组织，立刻快速研磨，反复几次，将组织研磨成粉末状。
（3）用高温处理后的小勺将粉末状的组织移至预先加入有1.0 mL Trizol的1.5 mL离心管中，并快速上下颠倒摇匀，置于室温大约10～15 min。此时提前预冷低温离心机待后面离心使用。
（4）将上述Trizol处理后的样品于4℃，12000 rpm离心10 min，吸取上清约900 μL 至另一新的1.5 mL无RNA酶离心管中，勿吸到沉淀。
（5）每个样品加入400 μL，剧烈摇动约30 s混匀，放于桌面上静止约3 min。
（6）将上述处理后的样品于4℃，12000 rpm离心10 min，小心吸取上清约400 μL至另一新的1.5 mL无RNA酶离心管中，加入500 μL异丙醇于上述离心管中，轻轻摇匀后，静止约10 min。
（8）静止后于4℃，12000 rpm离心10 min后，小心倒掉上清，保留沉淀。
（9）每个样品加入75%的乙醇溶液500 μL，轻轻将沉淀弹起清洗。
（10）将上述样品12000 rpm离心10 min后，倒掉上清保留沉淀，置于室温亮干至沉淀变透明为止。
p2p网络电视录像专家（11）每个样品加入上述高压处理后的ddH2O约30 μL（视沉淀的多少而定），置于室温让沉淀慢慢溶于ddH2O中，等完全溶解后再测各样品中RNA的浓度。
4.1.2 反转录合成cDNA（反转录试剂盒）
（1）参照反转录试剂盒说明进行
（2）再依次加入
RNA 1-2 μl （5-500ng）
Oligo（dT） 1.0 μL
Easy scripit RT/RI enzyme Mix 1.0 μL
gDNA romver 1.0 μL
RNA free water 可变量
总体积20 μL
轻轻混匀，放入42℃保温30 min，再85℃保温5秒失活Easy scripit RT/RI enzyme和gDNA romver。
（3）上述反转录产物暂时5×稀释后保存于－20℃备用。
4.1.3 PCR引物设计、扩增
（1）学习利用primer设计PCR引物。
（2）制备1% 琼脂糖凝胶。
（3）PCR反应体系（20 μL）及试剂如下所示：
2倍MIX 10.0 μL
上游引物 1.0 μL
下游引物 1.0 μl
模板 1.0 μl
H2O 7.0 μl
总体积20.0 μl
PCR扩增一般程序：先94℃预变性5.0 min, 再94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸1.5 min，共计进行30个循环，然后72℃终延伸5 min，最后4℃保存。
4、电泳检测：PCR反应完成后，取几微升做琼脂糖电泳检测目的基因的扩增情况。分别以基因组DNA和反转录cDNA为模板。具体扩增条件依课堂上老师提供试剂及引物情况再细微调整。
4.1.4 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测
（1）称取1 g琼脂糖加入250 mL锥形瓶中，量取100 ml 1× TAE电泳缓冲液加入锥形瓶。
（2）微波炉加热并多次摇晃锥形瓶使琼脂糖充分溶解。
塑料油箱（3）待胶冷却至60℃左右加入7 µL的核酸染料，轻摇混匀。
（4）向胶板中倒胶，插上梳子，静置约30 min待凝胶完全冷却。
（5）拔出梳子，将凝胶连同支撑用的模具一起转移到加入了1×TAE电泳缓冲夜的电泳槽中，使电泳缓冲液淹没凝胶，上样。150 V，200mA电泳约20 min。
（6）取出凝胶，扫胶记录电泳结果。
4.1.5 PCR产物回收(主要参照试剂盒说明)
（1）PCR扩增条件见前面。
（2）琼脂糖电泳后，切取目的条带处的琼脂糖约100mg，加入胶回收试剂盒中的S1溶液300μL，加热完全融化后取出，待样品降至室温后，依照胶回收试剂盒中的操作步骤回收目的条带，最后取2.0μL检测目的条带回收成功如否。
载体构建4.1.6 TA 克隆(Transgene公司的pEASY载体)
（1）上述回收片段与T载体室温连接。
（2）取出－80℃放置的感受态细胞，冰上放置慢慢融化。
（3）同时将上述连接产物放冰上预冷后，加入融化的感受态细胞中，迅速轻轻混匀后，置于冰上放置30min。
（4）在42℃金属浴加热器中热击90 s后，立刻置于冰中冰浴2.0 min。
（5）加入600μL高压灭菌后的LB液体培养基，于37℃摇床150rpm温和培养30 min。
（6）3000rpm离心3min后弃部分上清，保留约100μL上清并用灭菌头轻轻悬浮混匀沉淀，加入40μL的X-Gal和5μL的IPTG并混匀后，全部涂于预先制备好的100μg/μL氨苄青霉素固体培养基平板上。
（7）涂好的平板正置于37℃恒温培养箱中至少10min后，改为倒置培养过夜。
4.1.7 阳性克隆筛选及菌落PCR鉴定阳性克隆
（1）观察平板有无菌落生长情况？
（2）挑菌：取所需数量的PCR管，每管加10μl LB液体培养基，用灭菌牙签挑入一个白单菌落，轻轻吹打悬浮。
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（1）取1μl悬浮混合液，加入25μl PCR体系，用特异引物鉴定阳性菌落。
（2）反应条件ppzhus
94℃5min
94℃30s
50℃30s 30循环
72℃ 1.5 min
72℃ 5 min
4℃保存
（3）电泳检测：用琼脂糖凝胶电泳检测是否获得预期片段。
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