吴红媛;厉建中;张俊平
【摘 要】目的 构建核糖体蛋白RPS3a的腺病毒表达载体,并进一步验证其在细胞中的表达.方法 应用RT-PCR从人胚肾HEK293细胞的总RNA中反转录并扩增出RPS3a基因,并将RPS3a亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV中,酶切及测序鉴定后,再将含RPS3a基因的重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-RPS3a进行Pme Ⅰ酶线性化处理,转化到含有骨架质粒的BJ5183感受态菌,进行同源重组.鉴定后,经Pac Ⅰ线性化转染HEK293细胞,包装重组腺病毒.病毒感染NIH3T3细胞,Western blot 分析RPS3a蛋白的表达.结果 证实pAdTrack-CM V-RPS3a及pAdEas-RPS3a质粒构建正确;Western blot检测病毒感染的NIH3T3细胞总蛋白,与pAd-GFP阴性对照组相比,RPS3a蛋白表达量显著提高.结论 成功构建了能表达RPS3a基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其生物学功能奠定基础. 【期刊名称】《药学实践杂志》
【年(卷),期】2013(031)005
【总页数】4页(P347-350)
【关键词】RPS3a;腺病毒;构建;表达
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拉丝模【作 者】载体构建吴红媛;厉建中;张俊平
【作者单位】福建中医药大学,福建福州,350122;第二军医大学药学院生化药学教研室,上海200433;第二军医大学药学院生化药学教研室,上海200433;第二军医大学药学院生化药学教研室,上海200433
【正文语种】中 文
【中图分类】R318.5
核糖体蛋白是核糖体的重要组成部分。近年来的研究表明，核糖体蛋白除了在蛋白合成中起重要作用外，不同的核糖体蛋白还有凋亡、DNA修复、转录等核糖体外功能，如RPS7作为转录调节子，结合并调控维生素D受体-类视素X受体的转录激活； RPS3与NF-κB P65同二聚体和P65-P50异二聚体结合调控某些基因的表达，此外还具有DNA修复内切酶
压铸机料筒的设计和诱导凋亡的功能； RPL11与Myc结合抑制基因转录等[1]。核糖体蛋白RPS3a组成核糖体40S亚基，分子量为29.8KD。人、大鼠和小鼠RPS3a、TU-11、Fte-1、13T和nbl基因序列显示具有同源性[2,3]。研究发现，RPS3a也具有核糖体外功能，如RPS3a与Bcl-2共同作用抑制多聚(ADP-核糖)聚合酶活性[4]、与EB病毒编码的EBNA-5作用诱导病毒无限繁殖和激活B细胞[5]。为进一步研究RPS3a的功能，笔者采用重组腺病毒AdEasy系统，构建携带人RPS3a的重组腺病毒表达载体，并检测其在NIH3T3细胞中蛋白表达水平。
1.1 主要试剂 人胚肾HEK293细胞、大肠杆菌DH5α、腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV和含腺病毒骨架质粒的pAdEasy-1的BJ5183感受态菌株为本实验室保存。反转录试剂盒购自Promega；限制性内切酶Sal I、Hind III和T4连接酶购自Takara；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购于捷瑞公司；Trizol试剂和lipofectamine2000购于Invitrogen；KOD-Plus高保真PCR试剂购于Toyobo，RPS3a多克隆抗体购于Abnova，引物由上海生工生物工程公司合成。
1.2 主要方法
1.2.1 RT-PCR扩增RPS3a cDNA Trizol 法提取人胚肾HEK293细胞总RNA。在反转录反应
体系中以1 μg总RNA为模板，以随机引物合成cDNA，取1 μl cDNA产物为模板进行PCR扩增。扩增引物根据RPS3a序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物，并分别在正义链引物5′端加Sal I酶切位点，反义链5′端加Hind III酶切位点，RPS3a正义链引物：5′-GAA GTC GAC GCC ACC ATG GCG GTT GGC AAG AAC A-3′；反义链引物：5′-GAT AAG CTT AAA CAG ATT CTT GGA CTG G-3′。PCR扩增条件：94 ℃热启动4 min后，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30个循环，72 ℃反应5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.2 穿梭质粒pAdTrack-CMV-RPS3a的构建与鉴定 采用限制性内切酶Hind III和Sal I酶切PCR产物和pAd Track-CMV载体，酶切完全后，进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，并胶回收pAd Track-CMV载体质粒和RPS3a，用T4连接酶16 ℃连接过夜，将连接产物转化感受态DH5α菌，涂布于卡那霉素抗性LB平板上，37 ℃过夜。挑取单克隆分别在LB中37 ℃培养，用质粒小抽试剂盒提取质粒并酶切鉴定，阳性克隆进一步测序鉴定。
1.2.3 重组腺病毒载体pAdEasy-RPS3a的构建 pAdTrack-CMV-RPS3a质粒经Pme I酶切线性化后，转化含有骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态菌。在卡那霉素LB培养基平板筛选
转化菌，然后挑选形态较小的克隆，接种在卡那霉素(30 mg/ml)LB培养基上，37 ℃培养过夜。抽提质粒，经Pac I酶切鉴定正确后，再将质粒转化DH5α感受态细胞进行稳定扩增，以大量制备重组腺病毒质粒。
1.2.4 重组腺病毒pAd-RPS3a的包装与扩增 重组腺病毒质粒经Pac I酶切完全后，酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)抽提，乙醇沉淀纯化后，溶于无菌蒸馏水中。
HEK293细胞(1×106)接种于6孔板中，培养过夜达70%左右融合度时，按照Lipofectamine 2000说明书将上述酶切完全的重组腺病毒质粒pAd-RPS3a和对照质粒pAd-GFP转染细胞包装病毒。转染48 h后，荧光显微镜下观察GFP表达情况。待细胞大部分感染并从底部脱落时，收集细胞及培养液，液氮/37 ℃反复冻融3次，离心收集上清于-80 ℃保存。取部分上清继续感染HEK293细胞，扩增病毒。
1.2.5 Western blot检测重组腺病毒Ad-RPS3a的表达 用Ad-RPS3a和Ad-GFP分别转染NIH3T3 细胞，72 h后收集细胞，并用Western及IP裂解液(Beyotime公司)裂解细胞提取细胞蛋白，BCA法进行蛋白定量。样品加入5 × Protein loading Dye ，沸水浴5 min后，经12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白用电转仪(Bio-Rad公司)转移至硝酸纤维素(Nitrocellulo
se，NC)膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，尔后RPS3a多克隆抗体(1:1000)和β-actin(1:1000)经4 ℃孵育过夜，再加入带有荧光标记二抗山羊抗兔/鼠(1:5000)于室温孵育1 h， 1×PBST(含0.1% Tween-20)洗涤后，Odyssey激光成像系统进行扫描。
2.1 PCR扩增RPS3a PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见大小为800 bp左右的DNA片段(图1)，大小与预期RPS3a，795 bp相一致。
2.2 穿梭质粒pAdTrack-CMV-RPS3a的鉴定 穿梭质粒pAdTrack-CMV与目的片段RPS3a连接后，转化DH5α感受态细胞，质粒用Sal I和Hind III双酶切，得到9 kb左右和800 bp左右的片段(图2)，与预期结果一致。阳性克隆进一步测序鉴定，其序列正确(如图3)。
2.3 重组腺病毒pAd-RPS3a载体的鉴定 重组穿梭质粒经酶切线性化转化BJ5183感受态菌，卡那霉素培养基平板长出菌落，挑取克隆，抽提质粒用Pac I酶切，电泳结果有30 kb和3 kb两个片段(图4)，与预期结果相符，说明穿梭载体和骨架质粒同源重组成功。
2.4 重组腺病毒pAd-RPS3a载体的图谱 AdEasyTM重组腺病毒系统利用细菌内高度有效的同源重组机制及抗生素筛选，短期内便可获得表达外源目的基因的重组腺病毒，重组腺病毒载体的图谱如图5所示。
汽车膨胀水箱2.5 Western blot 检测NIH3T3 细胞 RPS3a 蛋白表达 Western blot 分析显示，与对照组Ad-GFP相比，NIH3T3 细胞感染重组腺病毒Ad-RPS3a后 RPS3a 蛋白水平显著提高(图6)。
核糖体蛋白S3a是由位于染体4上的单基因编码[6]。研究表明核糖体蛋白质S3a/nbl与凋亡密切相关[7,8]。Song等研究结果发现，RPS3a与Bcl-2相互作用抑制PARP活性从而阻止细胞凋亡，但当S3a缺失时，Bcl-2不能抑制PARP活性影响凋亡[4]。另有研究发现，放线菌素D可以引起持续高表达nbl的HL-60细胞的凋亡，但不能促进低表达量HepG2细胞的凋亡[9]。此外发现用全反式维甲酸促HL-60细胞分化，再用放线菌素D处理，结果抑制细胞凋亡[10]。用低表达RPS3a的NIH3T3细胞建立RPS3a高表达稳转细胞系，结果发现RPS3a高表达促进NIH3T3细胞成瘤，而抑制升高的RPS3a表达则促进细胞的凋亡[11]。但是RPS3a是否还有其他的核糖体外功能有待研究。
本研究在克隆人RPS3a基因基础上，将其克隆至重组穿梭质粒pAdTrack-CMV中，再转化入含骨架质粒的BJ5183感受态菌进行同源重组，成功构建了pAd-RPS3a的腺病毒表达载体。而后转染HEK293细胞，进行腺病毒载体的包装与扩增，并转染NIH3T3细胞验证。由于穿梭载体pAdTrack-CMV自身携带绿荧光蛋白基因，可重组至腺病毒骨架质粒pAdEas
y中表达，因此可通过观察GFP表达情况对病毒转染效率进行观察。本研究证明重组RPS3a腺病毒能成功在NIH3T3细胞中高表达，该结果为进一步研究RPS3a功能提供了必要的物质基础。
耐腐蚀热电偶【相关文献】
[1] Lindstrom MS. Emerging functions of ribosomal proteins in gene-specific transcription andtranslation[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,379(2):167.
[2] Lecomte F, Szpirer J, Szpirer C. The S3a ribosomal protein gene is identical to the Fte-1 (v-fos transformation effector) gene and the TNF-α-induced TU-11 gene, and its transcript level is altered in transformed and tumor cells[J].Gene,1997,186(2):271.
[3] Naora H , Nishida T , Shindo Y, et al. Antisense sequences of the nbl gene induce apoptosis in the human promyelocytic leukemia cell line HL-60[J].Leukemia,1998,12(4):532.
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