杨亚威;杨明明;龚月生
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【摘 要】为证明原位整合能否用于枯草芽孢杆菌芽孢表面展示外源蛋白,本研究将芽孢衣壳蛋白CotB、CotZ的编码序列(不含终止密码子),与绿荧光蛋白基因重组,构建含有融合片段cotB-gfp和cotZ-gfp的原位整合型表面展示载体pEYW25、pEYW26;将上述质粒分别转入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis PY79)获得重组菌株BSYW25和BSYW26.荧光显微镜下观察上述重组菌的芽孢,只有BSYW26能检测到荧光,Western blot结果显示BSYW26的芽孢外壳蛋白中含有GFP.结果表明原位整合作为一种新的表面展示方法能够应用于枯草芽孢杆菌芽孢表面展示.【期刊名称】《家畜生态学报》
【年(卷),期】2018(039)010
【总页数】6页(P10-15)
【关键词】芽孢;原位整合;表面展示
【作 者】节能烤箱杨亚威;杨明明;龚月生
载体构建【作者单位】西北农林科技大学 动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学 动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学 动物科技学院,陕西杨凌712100
【正文语种】中 文
【中图分类】S811.5
枯草芽孢杆菌虽为益生菌[1]，但其在动物肠道中停留时间短暂且易被机体降解，而芽孢能有效抵抗胃肠道中的酸碱环境，因此延长芽孢在肠道中的停留时间能够有效地发挥枯草芽孢杆菌的益生特性。
在环境恶劣，营养缺乏等极端条件下，枯草芽孢杆菌属的营养细胞会形成一种休眠体，即芽孢。枯草芽孢杆菌的芽孢包括中心内核和几种蛋白层结构，内核主要由高度失水的基因组构成，蛋白层结构由至少70种蛋白质组成，由内到外分为皮质层、基底层、芽孢内壳、芽孢外壳和crust层[2](图1)。
图1 芽孢外壳结构示意图Fig.1 Structure diagram of spore coat
芽孢用钌红染后在电镜下能观察到crust层[3]，外壳蛋白层主要有保护芽孢的作用，使其免受各种蛋白酶、有毒物质和恶劣环境因子等的影响。
在芽孢表面展示高粘附因子能够增强芽孢粘附肠道细胞的能力，但绝大多数已经报道的研究常采用异位整合的方式实现外源蛋白与芽孢衣壳蛋白的融合表达，表达效率低[4]。本研究尝试利用原位整合的方法构建一套芽孢表面展示载体，寻一种新的芽孢表面展示方法，选用两种芽孢衣壳蛋白CotB和CotZ作锚定蛋白，通过原位整合的方式尝试实现绿荧光蛋白在枯草芽孢杆菌芽孢表面的展示。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 引物、菌株、质粒和主要试剂 大肠杆菌(E.coli DH5α)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis PY79)为本实验室保存，分别作为克隆宿主菌和表达宿主菌。携带有绿荧光蛋白编码基因的质粒pEYW24为本实验室保存。各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、pGEM T-easy载体购自美国Promega公司；普通Taq DNA聚合酶、基因组提取试剂盒、DNA纯化回
收试剂盒、PCR纯化回收试剂盒等购自北京全式金生物技术有限公司，质粒小提试剂盒购自OMEGA，兔源GFP抗体及羊抗兔二抗购自西安嘉城生物科技有限公司。用于扩增外壳蛋白编码基因引物见表1，用于扩增芽孢衣壳蛋白编码基因的下游引物均不含终止密码子。
表1 引物名称及序列Table 1 Primers and sequences引物名称Primer name引物序列(5'→3')Primer sequence酶切位点Enzyme lociBPcotZ-upGCGGGATCCATGGAAAGCAGACCATATTCTTGBamHⅠBPcotZgggsAGAGCCACCGCCGAGGACAAGAGTGATAACTAGBPcotZ-downTTCTGCAGAGAGCCACCGCCGAGPstⅠBPcotB-upGGGGATCCATGAGCAAGAGGAGAATGBamHⅠBPcotBgggsAGAGCCACCGCCGGATGATTGATCATCTGBPcotB-downTTCTGCAGAGAGCCACCGCCGGATGPstⅠ
1.1.2 培养基 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均用普通LB培养基培养，在需要时分别加入氨苄青霉素(100 μg/mL)和壮观霉素(50 μg/mL)。
1.2 方法
1.2.1 原位整合型重组质粒的构建 以Bacillus subtilis PY79基因组为模板，分别以BPcotB-u单板层积材
p和BPcotBgggs,BPcotZ-up和BPcotZgggs为引物，扩增芽孢衣壳蛋白基因(在上游加入了BamHⅠ酶切位点，下游加入了GGGS连结肽)，体系回收PCR产物，再以PCR产物为模板，BPcotB-up/down，BPcotZ-up/down为引物扩增芽孢衣壳蛋白基因(在下游加入PstⅠ酶切位点)，体系回收PCR产物。上述PCR产物纯化后连接于pGEM T easy，酶切鉴定正确后送样测序。以BamHⅠ和PstⅠ酶切与pGEM T easy连接的两种重组质粒，以PstⅠ和SacⅠ酶切质粒pEYW24，回收cotB、cotZ和gfp片段，克隆于枯草芽孢杆菌整合型质粒pLX-2上，得到重组质粒pEYW25和pEYW26，构建流程图见图2。
图2 原位整合载体pEYW25和pEYW26的构建流程 cotB,cotZ为芽孢外壳蛋白编码基因；ColE为大肠杆菌复制子；MCS为多克隆酶切位点； Spec为壮观霉素抗性基因；gfp为绿荧光蛋白编码基因Fig.2 Flow diagram of construction strategy for single crossover integration vectors pEYW25 and pEYW26 cotB,cotZ：the coding genes of spore coat protein；ColE：replicon li；MCS：abbreviation of multiple cloning site；Spec：Spectinomycin resistance gene；gfp：the coding gene of green fluorescence protein
1.2.2 原位整合型重组菌的构建 将鉴定正确的整合型重组质粒pEYW25和pEYW26转化枯草
芽孢杆菌，质粒上带有的基因片段cotB和cotZ与枯草芽孢杆菌基因组上的同源片段发生单交叉同源重组，整个质粒被线性化地整合到染体上(图3)。
1.2.3 分子生物学操作 DNA的酶切、连接和转化大肠杆菌均按照分子克隆实验指南第三册的方法进行，质粒DNA的提取，酶切产物回收均按照试剂盒说明进行操作。
1.2.4 枯草芽孢杆菌的转化 采用Spizizen法[5]制备Bacillus subtilis PY79感受态细胞，-80 ℃保存。转化时将感受态细胞于45 ℃融化，加入适量的DNA，37 ℃，80 r/min培养30 min，将感受态细胞涂布在含壮观霉素的LB平板上，37 ℃过夜培养后进行筛选鉴定。
图3 重组菌BSYW25和BSYW26的构建流程图 cotB,cotZ为芽孢外壳蛋白编码基因；ColE为大肠杆菌复制子；MCS为多克隆酶切位点； Spec为壮观霉素抗性基因；gfp为绿荧光蛋白编码基因Fig.3 Flow diagram of construction strategy for recombinant strains BSYW25 and BSYW26 cotB,cotZ：the coding genes of spore coat protein；ColE：replicon li； Spec：Spectinomycin resistance gene；gfp：the coding gene of green fluorescence protein
1.2.5 枯草芽孢杆菌芽孢的制备及芽孢衣壳蛋白的提取 采用营养耗尽法[6]诱导枯草芽孢杆菌生孢，5 000 r/min离心10 min收集芽孢，重悬于1 mL无菌水中，加入终浓度为2 mg/mL的溶菌酶37 ℃处理1 h杀死营养体细胞，离心取上清，1 mL无菌水重悬。
取芽孢悬浮液离心去上清，加入适量的SDS-DTT溶液，37 ℃水浴保温2 h，用pH 8.0的1 mol/L Tris-HCl缓冲液洗涤数次，芽孢用等体积的裂解缓冲液重悬，置于冰上超声破碎，低温下8 500 r/min离心20 min收集芽孢，沉淀用PBS重悬。
1.2.6 枯草芽孢杆菌芽孢的显微拍摄 取10 μL芽孢悬浮液滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于NIKON正置荧光显微镜Ni-U载物台上，将激发光调至蓝光档观察绿荧光，利用NIS-Elements图像处理软件中的Color DS-Ri2调整曝光时间，在100倍油镜下观察荧光。
1.2.7 Western blot 分析 取200 μL的芽孢外壳蛋白提取液，加入等体积的上样缓冲液，95 ℃水浴10 min，10 000 r/min离心10 min取上清进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离胶浸在TBST转膜缓冲液5～10 min，电转采用恒流电转，电流大小由膜面积而定。电转使蛋白转移到PVDF膜上，然后将膜在封闭液中封闭1 h，加入兔源GFP一抗，室温反应2 h，再加入HRP标记的羊抗兔二抗，用HRP-DAB底物试剂盒进行显反应。
2 结果与分析
2.1 原位整合型重组质粒的构建
BamHⅠ和SacⅠ酶切鉴定质粒pEYW25和pEYW26，分别出现大小约为1.5 kb，1.3 kb的目的条带和1.8 kb大小的载体片段，与预期结果一致，表明含有融合基因cotB-gfp和cotZ-gfp的重组质粒构建成功，结果如图4。
图4 质粒pEYW25和pEYW26酶切鉴定 1,4:EcoRⅠ和SacⅠ双酶切质粒pEYW25, pEYW26; 2:Trans 1 Kb DNA Ladder；3:Trans 2Kb Plus DNA LadderFig.4 pEYW25 and pEYW26 digested by restriction enzyme 1,4:pEYW25 and pEYW26 digested by EcoRⅠ and SacⅠ; 2:Trans 1Kb DNA Ladder; 3:Trans 2Kb Plus DNA Ladder
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