2020年12月Dec.2020
第40卷第12期Vol.40,No.12
热带农业科学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
宁
敏②
陈本佳
胡庆毅
刘金涛
暴亚冲
滕浩宇
黄立钰③
(云南大学农学院/云南省多年生稻工程技术研究中心
云南昆明650504)
载体构建
摘
要
转录因子，也称反式作用因子，是调控生物基因转录表达的重要组成部分。其能够与基因启动子区的
顺式作用元件（cis -acting element ）相互作用，从而激活或抑制基因转录起始，在生物细胞内几乎参与所有生命活动的调控。本文构建了携带转录因子GAL4结合元件的双荧光素酶报告子载体和GAL4-BD 融合表达已知转录活性转录因子OsDRAP1和OsMADS57的效应子载体；利用农杆菌介导的烟草瞬时转化体系对该系统进行验证，结果显示，OsDRAP1具有转录激活功能，OsMADS57具有转录抑制功能，表明该系统具有较好的转录活性检测能力，且灵敏性较高，为植物转录因子功能研究和转录相关研究提供了新的技术支撑。关键词 转录因子；转录活性；双荧光素酶；GAL4
中图分类号
［Q751］
文献标识码
A
DOI ：10.12008/j.issn.1009-2196.2020.12.008
Development and Verification of Transcriptional Activity Analysis System for Plant
Transcription Factors
NING Min
CHEN Benjia
HU Qingyi
LIU Jintao
BAO Yachong
TENG Haoyu
HUANG Liyu
(School of Agriculture/Yunnan Research Center for Perennial Rice Engineering and Technology,Yunnan
University,Kunming,Yunnan 650504,China)Abstract Transcription factor (TF)is also known as trans-acting factor,and it is an important part in the regulation of transcriptional expression of biological genes,which can interact with cis -acting elements in the gene promoter region to activate or inhibit gene transcriptional initiation and participate in the regulation of almost all life activities in biological cells.A dual-luciferase reporter vector with GAL4cis -element which drives the luciferase reporter gene (LUC )and the effecter vectors with GAL4-BD for fusion expression of OsDRAP1and OsMADS57known TF transcriptional activity were constructed,and a transcriptional activity analysis system was verified by using the Agrobacterium -mediated transient tobacco transformation system.
The results showed that the OsDRAP1possessed transcriptional activation activity while the OsMADS57had transcriptional inhibition activity,which indicated that the transcriptional activity analysis system had a strong capability for transcriptional activity detection with high sensitivity and provides new technical support for plant transcription factor function study and transcription related research.
Keywords transcription factors ;transcriptional activity ;dual luciferase ;GAL4
在长期的自然选择过程中，植物为适应外界环境的变化，形成了对各种环境胁迫的适应性或
抗逆能力，以抵御环境胁迫对自身的伤害［1-2］。植物生长发育及环境胁迫响应相关基因主要包括两
①基金项目：云南省科技计划项目（No.2018IC096，No.2019ZG013，No.202001BB050050）；国家自然科学基金项目（No.32060474）。
收稿日期：2020-07-03；编辑部E-mail ：；责任编辑：龙娅丽；排版：龙娅丽。②宁敏（1994～），男，硕士研究生，研究方向为作物抗逆基因工程和分子育种，邮箱。③通讯作者：黄立钰（1983～），男，博士，副教授，研究方向为陆稻陆生适应进化的遗传和分子机制及多年生稻多年生性调控分子机制，邮箱。
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热带农业科学
类：一类是功能基因，另一类为调节基因。
转录因子（Transcription factor，TF），即反式作用因子，是能够与基因启动子区域中顺式作用元件特异相互作用的DNA结合蛋白。由于转录因子具有调节多个下游基因的功能，在植物生长发育和环境胁迫应对中扮演了重要角，已成为目前发掘和研究重要功能基因的热点。随着测序技术的飞速发展和各模式生物等物种基因组测序工作的完成，科研工作者利用生物信息学技术分析预测了大量转录因子［3-5］，目前已经鉴定了AP2/ EREBP、bZIP/HD-ZIP、bHLH、NAC、MYB和Zinc finger等众多转录因子家族及成员［6］。
转录调控区（transcription regulation domain）是转录因子发挥转录激活或转录抑制作用以调控目的基因表达的功能域，该区域通常是转录因子功能差异的主要原因。目前对于转录因子的转录活性分析有基于酵母体系的转录激活分析（GAL4-UAS系统），酵母激活体系源于酵母双杂交系统［7］及其衍生的酵母单杂交系统［8］和酵母三杂交系统［9］，该系统已在多种真核生物的基因功能研究上得到了
应用［10-11］。虽然利用酵母激活体系进行转录因子活性分析是一种普遍应用的常规方法，但该体系主要针对具转录激活活性的转录因子，且检测结果与植物体内环境结果可能存在较大差异，通常被用来做定性分析，而定量分析需要单独设置内参，如利用辅助报告基因（β-Gal、CAT和GUS），以实现报告基因测试结果的归一化，从而消除实验中不同测试间所固有的变化对实验准确度的干扰。因检测方法不同，操作比较复杂，易产生人为误差，且重复性差。由于某些蛋白转录活性较弱，导致相关报告基因没有表达或者虽然存在表达但量很少而不易被检测，尤其是对于具有抑制活性的转录因子研究更是缺乏适用的酵母技术体系。也有利用荧光素酶和双荧光素酶生物发光体系对转录活性研究的报道［12］，该系统可以灵敏、高效地检测转录因子的转录活性，但多数针对特定转录因子及其对应结合的顺式元件，或需要单独转化内参基因以进行归一化处理。因此，目前对于植物转录因子，尚还缺乏一个快速、通用、集合各方法优点的转录活性分
析体系。
该论文构建了携带GAL4结合元件（GAL4-UAS）［13-14］的双荧光素酶报告子载体，改造了基于Gateway技术的GAL4-BD（GAL4DNA Binding Do‐main）融合表达具转录激活活性的OsDRAP1［15］和具转录抑制活性的OsMADS57［16］的效应子载体，采用农杆菌介导的烟草瞬时转化体系对该系统进行了验证，实验证实了该分析系统的准确性和灵敏性，所获得的研究结果为今后探究候选转录因子基因的生物学功能、解析其转录调节机制提供了技术支撑。
1材料与方法
1.1材料
供试材料为水稻品种‘日本晴’（Oryza sa‐tiva L.，cv.Nipponbare）。将水稻种子用水培装置培养，待长到两叶一心时取适量水稻叶片，放入液氮中速冻，-80℃冰箱保存备用。
1.2方法
1.2.1基因克隆及载体构建
1.2.1.1RNA提取和cDNA合成FABS-034
水稻叶片总RNA提取根据OMEGA公司的Plant RNA Kit（R6827-01）的方法进行，采用NanoDrop One C（Thermo Fisher Scientific）微量核酸检测仪进行纯度和浓度检测，RNA置于-80℃冰箱保存。参照TIANGEN公司的快速反转录试剂盒（Cat#KR116-02）的方法，总RNA反转录成第一链cDNA后置于-80℃冰箱保存备用。
1.2.1.2双荧光素酶报告子载体的构建
交互式拼接屏
合成GAL4的DNA结合元件GAL4-UAS和含TATA box的35S minimal序列到克隆载体pUC57-G4U［17-18］，用限制性内切酶Kpn I和Spe I进行酶切消化并插入到pGreenII0800-LUC［19］荧光素酶报告基因（fireflyluciferase，LUC）前，利用测序引物pGreenII0800Seq-F：5′-CCCAGGATTCTTTTC‐CAATGCTA-3′测序验证并完成双荧光素酶报告子载体的构建，命名为pGreenII0800-GAL4（4×）-D1-3（4×）-mi35S。
1.2.1.3效应子载体构建
以pGBKT7质粒为模板，用PCR引物GAL4BD-F：
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宁敏等植物转录因子转录活性分析系统开发及验证
5′-CGGGGTACCATGAAGCTACTGTCTTCTATCGAAC-3′，GAL4BD-R：5′-TTGGCGCGCCGCGATACAGTCAACTGTCTTTGAC-3′克隆GAL4的DNA 结合结构域（GAL4-BD，amino acids1to147），用限制性内切酶Asc I和Kpn I进行酶切消化，替换pMDC43的GFP片段插入到pMDC43载体［20］，命名为pMDC43-GAL4BD，转化大肠杆菌DB3.1，挑取单克隆进行菌液PCR检测，阳性克隆用引物pM‐DC43Seq-F：5′-CCATTGGGATATATCAACGGTG-3′进行测序验证。目的转
录因子，即效应子基因，由CaMV35S（2×）启动子［21］和T-nos终止子（3′胭脂氨酸合成酶未翻译区）驱动［22］。
以上述cDNA为模板，用PCR引物OsDRAP1-CDS-F：5′-AGCATGGAGCAGCTGTTCGT-3′，OsDRAP1-CDS-R：5′-TTTGCTTTGTTCCTGACGACTTTC-3′和OsMADS57-CDS-F：5′-ATGGGGAGGGGGAAGATAGT-3′，OsMADS57-CDS-R：5′-TTAAGGCAGATGAAGTCCCAG-3′分别克隆OsDRAP1（LOC_Os08g31580）和OsMADS57（LOC_Os02g4984 0）全长编码区序列，TA克隆法插入pGWC-T［23］。利用Gateway技术LR反应［20］将目的基因编码区序列插入pMDC43-GAL4BD，使目的基因与GAL4-BD融合，并用引物BD-F：5′-TGCGACATCATCATCGGAAG-3′对重组质粒测序验证，即完成效应子载体BD-OsDRAP1和BD-OsMADS57构建。
1.2.2转录因子转录活性系统的验证
将报告子载体pGreenII0800-GAL4（4×）-D1-3（4×）-mi35S与辅助质粒pSoup-P19［19］共转化、BD-OsMADS57、BD-OsDRAP1分别转化农杆菌EHA105，在含有利福平和卡那霉素的YEB培养基上筛选，挑取阳性克隆至2mL YEB液体培养基，培养过夜。将过夜的菌样转移至30mL液体YEB培养基中扩大培养至OD6000.5～0.8；室温，4000r/min 离心5min，弃掉上清液后使用用30mL重悬液（10mmol/L MgCl2，10mmol/L MES，pH5.6；高温高压灭菌后，加100μmol/L乙酰丁香酮）重悬菌
体，室温放置23h。报告子菌株或单独或与效应子菌株混合（报告子∶效应子为7∶3）置于2mL注射器中，用手小心按压注射到45周大的成熟的烟草叶片，每个处理注射3株以上，每株注射3片叶子，用记号笔标记烟草叶片水渍状区域。将注射后的烟草培养3d［15］。
采集相关叶片样本，分别对叶片组织、研磨匀浆及总蛋白进行荧光素酶活性鉴定，3个生物学重复，每个生物学重复设置3次技术重复。利用双荧光素酶反应检测试剂盒（DLR，Promega，E1910）、多功能酶标仪（SpectraMax i3）测定萤火虫荧光素酶活性（LUC）后，在反应中加入Stop and Glow buffer（Promega）100μL灭活萤火虫荧光素酶，并启动海肾荧光素酶（Renilla lucif‐erase，REN）反应，测定REN活性，根据LUC/REN 比值对目的基因转录活性进行分析，验证该报告系统的正确性。利用活体成像系统进行叶片活体拍照（NightShade LB985）。
2结果与分析
小型锅炉
2.1双荧光素酶报告子载体的构建
选取了pGreenII0800-LUC作为基础载体进行改造，该载体同一T-DNA区域具有LUC和REN两种报告基因。用限制性内切酶Kpn I和Spe I从pUC57-G4U质粒上酶切人工合成的GAL4DNA结合元件GAL4-UAS-mi35S，得到GAL4（4×）-D1-3（4×）-mi35S（189bp）（图1-A、1-B）。目的片段纯化后，用T4连接酶连接到报告载体pGreenII 0800-LUC上，得到报告子载体pGreenII0800-GAL4（4×）-D1-3（
4×）-mi35S，对重组质粒进行酶切鉴定和测序验证，如图1-C所示，目的片段大小与实际片段大小一致，且测序结果正确。
利用GAL4的DNA结合元件并在其后增加了TATA box和mi35S启动子（图1-A），以增加LUC在植物细胞中的本底表达水平，进而提升对照样品的可靠性和灵敏度。作为内参的REN受35S启动子驱动，与LUC报告基因位于同一T-DNA上，可以消除瞬时转化效率的误差。
电池盖帽2.2效应子载体构建
为得到较为通用的效应子载体，选取了基于Gateway技术的pMDC43载体，并克隆GAL4的DNA结合域（GAL4-BD）（图2-A），目的片段GAL4-BD纯化后，用限制性内切酶Kpn I和Asc I进行双酶切，再用T4连接酶连接到效应载体pMDC43上，替换该载体原有GFP标签。重组质粒pMDC43-GAL4BD的酶切鉴定产物如图2-B所示，片段大小为441bp，符
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热带农业科学合预期，重组质粒经测序验证正确。
水稻叶片总RNA 提取根据OMEGA 公司的Plant RNA Kit （R6827-01）的方法进行，采用NanoDrop One C 测得RNA 浓度为470.42ng/μL ，A 260/A 280为2.14，A 260/A 230为2.10；结合琼脂糖凝胶电泳，结果显示所提取RNA 完整性好，质量纯度均符合实验要求（图2-C ）。以反转录后的第一链cDNA 为模板，克隆了OsDRAP1（843bp ）和OsMADS57（726bp ）全长编码序列（图2-D ），TA 克隆至中间载体pGWC-T 上测序验证，进而通过LR 反应将其分别插入到pMDC43-GAL4BD 中，形成35S （2×）强启动子驱动的BD-OsDRAP1和BD-OsMADS57融合表达效应子载体。2.3
转录因子OsDRAP1和OsMADS57转录活性分析目前对荧光素酶反应检测的样品通常有组织本身、研磨匀浆和提取蛋白3种方法。本研究利用报告子载体pGreenII 0800-GAL4（4×）-D1-3（4×）-mi35S 和效应子载体BD-OsMADS57（图3-A ）共转化烟草比较了上述3种方法，从图3-B 可以看出，3种方法最终检测LUN/REN
值没有显著差异，
A.GAL4（4×）-D1-3（4×）-mi35S 序列组成；
B.pUC57-G4U 双酶切；
C.重组质粒pGreenII 0800-GAL4（4×）-D1-3（4×）-mi35S 双酶切鉴定；M.DL2000Marker ；1.GAL4（4×）-D1-3（4×）-mi35S 双酶切产物；2.pGreenII 0800-GAL4（4×）-D1-3（4×）-mi35S 双酶切产物；3.pGreenII
0800-LUC 空载体双酶切产物。
图1pGreenII 0800-GAL4（4×）-D1-3（4×）-mi35S
报告子载体构建
A.GAL4-BD 的PCR 扩增；
B.重组质粒pMDC43-GAL4BD 构建；
C.水稻总RNA 电泳图；
D.OsDRAP1和OsMADS57全长CDS 的PCR 扩增；M.DL 2000Marker ；1、2.GAL4-BD PCR 产物；3、4.pMDC43-GAL4BD
双酶切产物；5.pMDC43载体双酶切产物，722bp 为GFP 基因片段。
图2pMDC43-GAL4BD 效应子载体构建
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宁敏等植物转录因子转录活性分析系统开发及验证
说明3种方法均可以使用。但叶片（打孔）本身和研磨匀浆与提取蛋白检测相比，误差较大，而利用蛋白检测误差最小（图3-B ）。因此，提取蛋白并进行LUC/REN 的测定分析更精确。
为了验证该转录因子转录活性系统的正确性，以效应子BD-OsDRAP1和BD-OsMADS57为驱动因子（图3-A ），验证OsDRAP1和OsMADS57的转录活性（图3-C 、3-D ）。结合上述分析，利用提取蛋白方
法对荧光素酶活性进行检测，与对照（单独注射报告子菌株）相比，烟草中同时注射BD-OsDRAP1效应子菌株和报告子菌株，LUC/REN 比值显著升高，而注射BD-OsMADS57效应子菌株和报告子菌株LUC/REN 比值显著降低（图3-C ），活体成像显示，OsDRAP1可以激活报告基因LUC 表达活性，而Os‐MADS57抑制LUC 表达活性（图3-D ）。
3讨论
转录因子通过调控目的基因的转录来发挥功
能。目前对于转录因子的转录活性分析有比较传统的、用来做定性分析的酵母转录激活分析体系，但由于该系统是在体外进行实验，与植物体内的
结果可能存在较大差异，往往需要设置多组严格的对照以消除假阳性、假阴性或人为误差对实验结果准确性的影响，不仅重复性较差，操作起来也比较复杂。为提高植物转录因子转录活性研究
的灵敏度，并尽可能模拟植物体内转录因子发挥
A.效应子载体和报告子载体结构示意图；
B.样品直接（打孔）检测、研磨匀浆检测、提取总蛋白检测的比较；
C.报告子pGreenII 0800-GAL4（4×）-D1-3（4×）-mi35S 分别与效应子BD-OsDRAP1或BD-OsMADS57的烟草瞬时转
化实验验证；**代表p ＜0.01水平t 测验差异显著；D.烟草叶片LUC 活性的活体成像检测。
图3OsDRAP1和OsMADS57转录活性分析
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