指定文件：E640-06（2012重新审核）
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本标准是在修正过的指定文件E640下发表的。紧跟指定文件的数字表明最初采用的年限或者在修改的情况下，最后一次修改的年限。在括号中的数字表示最新从新审核的年限。上标epsilon（s）表明从最新的修正或者审核发生了编辑改变。
1.范围
1.1 本测试标准覆盖了化妆品生产中防腐剂适合使用浓度。它确定了防腐剂在样品中有效的最少需求量。
1.2 数据单位都是采用国际单位制，本标准中测试没有采用其他单位。
1.3 本标准目的不是标榜所有的安全含量，如果存在，是与具体使用相联系。使用者可以根据此标准建立合适的安全健康做法，确定更实用的监管限制。
2．参考文献
2.1. ASTM标准
E1054抗菌物质中灭活剂的评价测试方法
3．方法概要
3.1.此测试方法包含，将防腐剂按照特定浓度加入到样品中的微生物挑战实验。常规微生物培养过程用来确定防腐剂在样品中的抗菌效果。此方法需要标准微生物技术的知识。 4．意义
4.1.此方法用来确定防腐剂，或者防腐剂体系是否能用来做与水混合化妆品产品的防腐。
变电站模型5．材料
5.1测试配方测试中用到的提交者认为能够有效防腐的配方。那些配方不防腐的样品。防腐剂与配方或者配方中的化合物不相溶的话都要被标出。
5.2.1微生物测试（推荐面板）
其他测试微生物或者等量的样品合适并且，标准细菌分离培养可行。培养基的最基本功能室为不同的防腐剂比较提供基础。
5.2.1.1铜绿假单胞菌A TCC 9027
5.2.1.2洋葱伯克霍尔德菌ATCC 25416
5.2.1.3大肠杆菌A TCC8739
5.2.1.4金黄葡萄球菌A TCC 6538
5.2.1.5 白念珠菌ATCC10231
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5.2.1.6 日勾维肠杆菌A TCC 33028
5.2.1.7黑曲霉ATCC 16404
5.2.1.8平滑正青霉ATCC 10464
5.2.2如果情况允许，最好可以加入化妆品中的腐败菌，或生产环境中引入的杂菌，加入5.2建议的细菌。
5.3细菌培养基5.2.1列出的微生物应该按照ATCC规定的那样培养。
5.3.1培养皿稀释剂——稀释剂是为在培养皿中培养分散测试样品。如果需要出最合适的幸存微生物可以加入防腐剂的中和剂。稀释剂的选择依赖于稀释能力，且需要满足5.3.3中
规定的中和要求。以下建议的稀释剂被证明是适合此目的。
5.3.1.1生理盐水中加入1%的蛋白胨
5.3.1.2中和培养液
5.3.1.3琼脂培养液
5.3.1.4琼脂培养液
5.3.1.5改进型琼脂培养液
5.3.1.6营养肉汤
5.3.1.7磷酸盐缓冲剂
5.3.1.8TA T 培养液
5.3.1.9大豆培养基
5.3.2培养介质——培养介质要为选中的测试微生物提供足够的营养。下面建议的琼脂有那样的功能。
5.3.2.1 细菌培养
营养琼脂
平板计数琼脂
5.3.2.2 霉菌培养
沙氏琼脂
5.3.3 防霉剂中和剂——中和剂是跟稀释剂或者培养介质混合，或者两者都有。目的是为了是防腐剂失活，以便得出微生物含量的准确含量。中和剂不可用或者无效时，要稀释或者用滤膜法。
6.过程
6.1挑战菌种的准备——将细菌在合适的固体介质斜面上在35±培养48-72小时。将霉菌培养基在25±2℃下培养5到7天，或者到孢子长满。
6.1.1 细菌培养——用一个无菌环形接种环，将生长菌从每个培养基转移到生理盐水中。分别用无菌生
理盐水清洗斜面培养基转移到无菌试管中。调整悬浮液为大约1*108cfu/ml。麦克法兰硫酸钡2#标准，浑浊度测定，光学密度或者其跟培养基计数有关的其他技术。确认培养基标准时用的确定的好氧培养基。
6.1.2酵母菌，真菌培养——真菌培养基如6.1.1描述，但是要调整浑浊液浓度为1*107cfu/ml。确认培养基标准时好氧霉菌培养技术
6.1.3 霉菌培养——霉菌孢子培养通过添加含有0.05%聚山梨醇酯80的无菌盐水到培养基，并且用无菌接种环或其他合适的装备接种。通过无菌纱网过滤，无菌玻璃丝，或者无菌不吸收棉花。调整霉菌报纸悬浮液为1*107cfu/ml。使用血细胞计数器，或者微生物直接计数技术。确认培养基标准使用好氧霉菌培养基计数。霉菌孢子培养可以立即使用或者在2到5℃下最多四周。
6.1.4接种物准备
6.1.4.1 混合培养基方法
(1)混合细菌——混合相同含量的选中细菌并且标为“细菌1”蜗轮副
（2）混合选择的培养基——为革兰氏染阳性细菌，革兰氏染阴性发酵细菌和革兰氏染阴性没有发酵细菌，混合分离细菌培养基。混合培养基可以立即使用或者在2到5℃下最多储存72小时。
（3）霉菌——混合相同含量的霉菌悬浮液，标为“霉菌2”
6.1.4.2纯净培养基方法——挑战培养也许会需要单个纯的培养基。如果选用此种方法，准备挑战用培养基如在6.1描述并且直接入6.3所描述那样用。根据挑战样品用微生物来合适标示样品。
6.1.5决定挑战接种物水平——准备系挑战接种物（6.1.4.1）的一些列稀释剂。使用琼脂培养基一式两份的倒入培养皿。细菌和酵母菌在32℃下孵化24小时，霉菌在25℃下孵化72小时。确定每种接种液中的细菌形成单位。
6.2样品准备，称取20g整测试材料放在合适的玻璃容器中并且标示，覆盖放在恒温（20到25℃）中存放
6.3测试形成挑战——通过每20g整测试材料添加0.2ml接种液接种。通过摇晃，搅拌，或者使用其他合适混合仪器。存放接种样品在恒温（20到25℃）下。
6.4微生物测试
6.4.1 充分混合接种样品。准备1：10稀释（一部分测试材料加9部分中和稀释剂）并充分混合。另外需要准备按要求的10倍稀释，将稀释的测试样品倒入合适的为细菌和霉菌选定的培养基中。
6.4.1.1倒转细菌培养基，并且在35±2℃下培养48到72小时，数培养皿上面的菌落数。25到250cfu的范围是可以接受的。合适的时候可以用革兰氏染法确定微生物的特性。
6.4.1.2 倒转霉菌培养基在25±2℃下培养3到5天。数培养皿的菌落数。8到80的霉菌菌落数是可以接受的。
6.4.1.3如果没有培养基落在可以接受的范围内，数出离那个范围醉君的菌落数。平均平行培养皿数，记录为测试材料的形成菌落数。
6.4.2测试时间间隔——测试接种样品在最小建议时间间隔，0，7,14,21（选择）和28天（另外测试间隔可以也可以选择）
6.3.再次挑战——如果使用了防腐剂的化妆品一直被消费者投诉，要考虑做一次重新挑战。从新挑战在21或者28天，继续测试28天，重复所有为原始挑战描述的过程。
7.数据解释
7.1以下可以用在展示，化妆品体系中防腐剂的效果。
7.1.1细菌和酵母菌应该至少减少99.9%在每次挑战七天之内，并且测试剩余的在合适的数据范围内没有增加；
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7.1.2霉菌应该至少90%在每次挑战的七天之内，并且测试剩余的在合适的数据范围内没有增加
7.2计算减少的百分含量如下
减少量（%）=（接种数-样品数*10）/接种数
7.3未经处理过的测试材料必须含有少于100cfu/g的挑战过程
7.4接种数必须在先前描述的范围内，否则认为测试结果无效，必须重做
7.5如果防腐剂的中和剂是没有被证明过的，那测试时无效的，不能重复，直到到合适的中和剂，或者改变过程。
8．试验误差
偏差没有涉及到，推荐采用平行样品。
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