(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
人体检测
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011592251.5
(22)申请日 2020.12.29
(71)申请人 东南大学
地址 210024 江苏省南京市玄武区新街口
街道四牌楼2号
(72)发明人 刘必成 汤涛涛 王彬
(74)专利代理机构 北京同辉知识产权代理事务
所(普通合伙) 11357
代理人 饶富春
(51)Int.Cl.
C07K 7/06(2006.01)
A61K 31/713(2006.01)
A61K 47/62(2017.01)
A61K 47/69(2017.01)
多肽修饰
A61P 13/12(2006.01)
(54)发明名称
用
(57)摘要
本发明公开一种肾损伤分子‑1(Kim ‑1)靶向
感温元件
多肽及其应用，属于生物医药领域。本发明公开
的Kim ‑1靶向多肽优选LTH，其氨基酸序列为：
LTHVVWL；其特异性结合于损伤肾脏。基于所述靶 向多肽LTH，本发明还提供了一种可靶向损伤肾
脏的靶向递送系统。权利要求书1页 说明书6页序列表3页 附图2页CN 112694518 A 2021.04.23 C N 112694518
A
1.一种靶向多肽，包含选自SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或与上述任一序列具有至少80％同源性的序列。
2.一种肾脏靶向递送系统，其特征在于，包括源自红细胞的细胞外囊泡和权利要求1的靶向多肽。
3.根据权利要求2所述的肾脏靶向递送系统，其特征在于，所述肾脏靶向递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从红细胞中分离提纯细胞外囊泡；
(2)使用点击化学的方法将权利要求1的靶向多肽加载到细胞外囊泡膜上形成肾脏靶向递送系统；
4.根据权利要求3所述的肾脏靶向递送系统的应用，其特征在于，肾脏靶向递送系统负载的药物为靶向P65和Snai1基因的siRNA分子。优选地，所述siRNA分子的序列为：
P65 siRNA：正义链：5’‑GGAGUACCCUGAAGCUAUATT ‑3’
反义链：5’‑UAUAGCUUCAGGGUACUCCTT ‑3’
Snai1 siRNA：正义链：5’‑GGAAGAUCUUCAACUGCAATT ‑3’
反义链：5’‑UUGCAGUUGAAGAUCUUCCTT ‑3’
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，负载siRNA分子的肾脏靶向递送系统应用于制备改善肾脏炎症和纤维化的药物或制剂。
6.一种诊断或肾脏病的药物或制剂中含有权利要求1所述的靶向多肽。
7.一种诊断或肾脏病的药物或制剂中含有权利要求2所述的靶向递送系统。
权 利 要 求 书1/1页CN 112694518 A
一种肾损伤分子‑1(Kim‑1)靶向多肽及其应用
技术领域
[0001]本公开属于生物医药领域，具体涉及一种肾损伤分子‑1(Kim‑1)靶向多肽及其应用。
背景技术
[0002]肾损伤分子‑1(Kidney injury molecule‑1，Kim‑1)是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，由细胞外Ig样结构域、跨膜结构域和细胞内结构域构成。在健康肾脏中，Kim‑1 几乎不表达；但是在各种原因导致的肾脏疾病中，Kim‑1特异性高表达于损伤的肾小管上皮细胞，已成为多种肾脏病如急性肾损伤的早期诊断标志物。同时， Kim‑1的肾脏特异性表达也提示，靶向Kim‑1可以作为肾脏病精准的有力策略。因此，本发明利用噬菌体展示技术筛选获得和Kim‑1蛋白特异性结合的多肽，并确认靶向多肽和损伤肾脏的结合能力。此外，基于该靶向多肽，我们还提供了一种肾脏靶向递送系统。
[0003]近年来，细胞外囊泡作为天然稳定的递送载体，具有低免疫原性、无细胞毒性和较好的生物屏障通透性等优点，在疾病的诊断和中具有广阔的应用前景。现有研究证实，细胞外囊泡可以作为小分子物质、核酸和蛋白质的有效载体。此外，将靶向肽、核酸适配体等连接到细胞外囊泡表面可以提高它们的器官/细胞靶向性。然而，特异性靶向损伤肾脏的方法仍然有限。本发明通过将开发的Kim‑1靶向多肽修饰到红细胞来源的细胞外囊泡上，成功构建了肾脏靶向递送系统，为将来肾脏病的诊治提供新的途径。
发明内容
[0004]本公开的目的可以通过以下技术方案实现：
[0005]本发明的目的在于提供一种Kim‑1靶向多肽，可与损伤肾脏高效、特异的结合，并基于该靶向多肽，开发一种肾脏靶向递送系统，为肾脏病的诊断或提供新的策略。[0006]本发明的技术方案如下：
[0007]本发明提供一种靶向多肽，包含选自SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或与上述任一序列具有至少80％同源性的序列，再优选为至少具有90％相同性，更优选为至少具有95％、96％、97％、 98％、99％的相同性。
[0008]本发明提供一种肾脏靶向递送系统，其特征在于，包括源自红细胞的细胞外囊泡和所述靶向多肽。
[0009]本发明还提供所述肾脏靶向递送系统的制备方法，包括以下步骤：
[0010](1)从红细胞中分离提纯细胞外囊泡；
[0011](2)使用点击化学的方法将所述靶向多肽加载到细胞外囊泡膜上形成肾脏靶向递送系统；所述靶向多肽优选SEQ ID NO.5的序列；
[0012](3)将所述肾脏靶向递送系统应用于肾脏病。
[0013]本发明所述肾脏靶向递送系统在肾脏病中的应用，其特征在于，肾脏靶向递送系统负载的药物为靶向P65和Snai1基因的siRNA分子。优选地，所述siRNA 分子的序列为：
衣物加香[0014]P65 siRNA：正义链：5’‑GGAGUACCCUGAAGCUAUATT ‑3’
[0015]反义链：5’‑UAUAGCUUCAGGGUACUCCTT ‑3’
[0016]Snai1 siRNA：正义链：5’‑GGAAGAUCUUCAACUGCAATT ‑3’
[0017]反义链：5’‑UUGCAGUUGAAGAUCUUCCTT ‑3’
[0018]本发明所述的负载siRNA分子的肾脏靶向递送系统应用于制备改善肾脏炎症和纤维化的药物或制剂。
[0019]本发明所述的靶向多肽在制备诊断或肾脏病的药物或制剂中的应用。
[0020]本发明所述的肾脏靶向递送系统在制备诊断或肾脏病的药物或制剂中的应用。海量数据查询
[0021]本发明的有益成果：
[0022]1、本发明首次提供了高效、特异的Kim ‑1靶向多肽，且由于Kim ‑1蛋白在多种原因引起的肾脏病中均高表达，因此本发明提供的靶向多肽具有较广的应用范围；
[0023]2、本发明提供的肾脏靶向递送系统可以特异性靶向损伤肾脏，且细胞外囊泡可以作为小分子药物、基因类药物和蛋白质类药物的递送载体，在肾脏病的靶向中具有非常可观的应用前景；
[0024]3、本发明的制备方法简单、易操作、反应效率高，红细胞数量充足、来源广泛，可以进行规模化生产。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0026]图1为Kim ‑1靶向多肽与Kim ‑1蛋白的结合力验证结果图；
[0027]图2为Kim ‑1靶向多肽与损伤肾脏的结合力验证结果图；
[0028]图3为肾脏靶向递送系统的鉴定结果图：(A)未经修饰的细胞外囊泡(REV) 和连接有选自SEQ ID
NO.5靶向多肽(命名为LTH)的细胞外囊泡(REV LTH ) 的粒径分布图；透射电镜观察REV LTH 的形态；(B)Western blot检测REV和 REV LTH 上细胞外囊泡和红细胞的标志蛋白；
(B)免疫荧光检测靶向多肽LTH 与REV的共定位情况；
[0029]图4为肾脏靶向递送系统与损伤肾脏的结合力验证结果图：(A)肾脏离体成像；(B)免疫荧光检测REV LTH 与Kim ‑1阳性肾小管的共定位情况；
[0030]图5为肾脏靶向递送系统负载siRNA分子的鉴定结果图：(A)负载siRNA 分子REV LTH 的粒径分布图和透射电镜图；(B)siRNA分子加载效率；
[0031]图6为负载siRNA分子的肾脏靶向递送系统急性肾损伤的结果图：(A) HE染观察肾脏病理改变；(B)RT ‑PCR检测肾组织中促炎因子和促纤维化因子的mRNA水平。具体实施方式
[0032]下面将结合本公开实施例中的附图，对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本公开中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它
实施例，都属于本公开保护的范围。
[0033]实施例1 Kim‑1靶向多肽的筛选与验证
[0034]1、Kim‑1靶向多肽的筛选
[0035]实验步骤如下：
[0036](1)体外重组的Kim‑1蛋白按40μg包被到ELISA板中，4℃包被过夜；
[0037](2)用含0.05％Tween的PBS洗3次，洗去多余抗原；
[0038](3)加入5％BSA封闭液，30℃封闭2小时；
[0039](4)吸去封闭液，加入噬菌体随机展示文库(1011pfu)，37℃孵育2小时；[0040](5)用含0.05％Tween的PBS洗5次，洗去未结合的噬菌体；
[0041](6)加入Glycine‑HCl缓冲液(pH 2.2)洗脱结合的噬菌体，然后加入Tris‑HCl 缓冲液(pH 9.1)中和；
[0042](7)对洗脱物进行滴度测定，并用Escherichia coli TG1进行扩增；
[0043](8)按上述方法利用上轮淘选回收扩增所得的噬菌体产物反复对Kim‑1蛋白进行淘选；
[0044](9)在进行五轮淘选后，利用多克隆噬菌体ELISA验证每轮淘选获得的噬菌体产物与Kim‑1的结合力；
[0045](10)分别挑选96个来自第二轮和第四轮淘选获得的单克隆噬菌体，进行单克隆噬菌体ELISA验证其与Kim‑1的结合力；
[0046](11)挑选结合力最高的5个单克隆噬菌体进行二代测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑NO.5所示。
[0047]2、候选Kim‑1靶向多肽与Kim‑1蛋白结合力测试
[0048](1)用RIPA裂解液裂解缺血再灌注损伤后的肾组织备用；
[0049](2)由强耀生物科技有限公司合成带有组氨酸(H6)标签的Kim‑1靶向多肽和对照肽Scramble(Scrbl)；农业交易
[0050](3)分别将100μg带有组氨酸标签的Kim‑1靶向多肽与镍磁珠(苏州海狸生物医学工程有限公司)在4℃孵育2小时，使Kim‑1靶向多肽连接到镍磁珠上；
[0051](4)用Washing buffer[20mM Phosphate Buffer,500mM NaCl,and 75mM imidazole(pH 7.4)]清洗3次去除未结合的多肽；
[0052](5)将300μg肾组织裂解液与上步获得的镍磁珠在4℃孵育1小时；
[0053](6)用Washing buffer[20mM Phosphate Buffer，500mM NaCl，75mM imidazole (pH 7.4)]清洗3次去除多余的肾组织裂解液；
[0054](7)用Elution buffer[20mM Phosphate Buffer，500mM NaCl，500mM imidazole (pH 7.4)]洗脱镍磁珠上结合的蛋白；
[0055](8)用Western blot检测上步洗脱下来的蛋白中Kim‑1的含量；
[0056]结果见图1，相比于对照肽Scrbl，5条候选多肽均可以结合肾组织中的Kim‑1 蛋白；其中，候选多肽LTH结合的Kim‑1蛋白最多，提示其与Kim‑1的结合力最强。
[0057]3、候选Kim‑1靶向多肽靶向损伤肾脏的能力测试
[0058]小鼠行单侧(右侧)肾脏缺血再灌注手术，肾脏缺血时间为35分钟；在肾脏再灌注后，通过尾静脉注射25mg/kg的带有FITC标记的Kim‑1靶向多肽；注射6小时后处死小鼠，留
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