张瑞，苏小川
广西壮族自治区疾病预防控制中心，南宁
530028
中图分类号：R 155.5+5
文献标识码：A
文章编号：1673-758X(2018)04-0332-04
作者简介：张瑞（1982—），男，河北抚宁人，主管技师，研究方向为理化检验技术。
·综述与讲座·
瘦肉精，又名盐酸克伦特罗（Clenbuterol ），是一种特定的可以用来减少饲养类动物的脂肪、增加其瘦肉比例的廉价激素类药物，目前已发展成为包括：特布他林（Terbutaline ）、莱克多巴胺（Ractopamine ）、沙丁胺醇（Salbutamol ）、塞曼特罗（Cimaterol ）、溴布特罗（Brombuterolhydr
ochlo-ride ）、马布特罗（Mabuterol ）等10多种化合物的一类药物，统称为瘦肉精。这类药物是人工合成的拟交感胺类化合物，基本化学结构为β-苯乙胺，因此，也称之为β-受体激动剂（β-agonist ）类激素药物，按其取代基类型可分为苯胺型、苯酚型、苯二酚型3大类，代表药物分别为克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺。食用含有瘦肉精的畜禽肉、奶、蛋、鱼等食品，可使人体产生明显的中毒症状[1]。鉴于瘦肉精的危害性，中国以及许多国家已经禁止或严格限制其使用。
目前常用的瘦肉精检测方法主要有酶联免疫法（ELISA ）和仪器检测法两大类。酶联免疫法是较早使用于血液、尿液等生物检材的快速检测方法之一，它是利用盐酸克伦特罗只具有免疫反应性，不具有免疫原性的小分子半抗原特性，与大分子载体交联合成完全抗原，再采用相应试剂盒通过颜反应进行检测[2] 。该法的主要优点是快
速，便捷，但检测对象单一，用于动物组织检测容易出现假阳性结果。仪器检测法主要有气相谱-质谱联用法（GC-MS ）和液相谱-质谱联用法（LC-MS ），这两种检测方法都是利用谱分离原理，把瘦肉精从复杂的样品基质中分离出来，通过质谱检测器对其进行结构信息确证而达到检测目的。仪器检测法的主要优点是定性、定量准确，检测结果可靠，是目前常用的检测方法。由 于不同的仪器排除复杂基质干扰的能力不同，样品前处理后的净化效果直接影响检测结果的准确性，
因此，样品净化是仪器法检测瘦肉精的重要步骤之一[3-6]，被作为一种前处理方法加以研究。现将瘦肉精检测中的前处理方法综述如下。1
酶联免疫检测前处理方法
酶联免疫法的样品前处理较为简单，一般的生物检材样品如血液、尿液等无需稀释或净化即可直接检测，美国学者Hagedore 等[7]较早报道采用ELISA 检测马的血浆及尿液中的克伦特罗，该实验将0.8μg/kg 浓度的克伦特罗注射液通过静脉注入马的体内，用ELISA 直接检测马的血浆原液及稀释的尿液，均分别于24小时、96小时后检出克伦特罗，如以口服方式进行加标实验，检出时间比静脉注射方式长，阳性结果需用HPLC 确证。罗晓琴等报道中国一些生物技术公司已经研制出瘦肉精快速检测三联卡[8]，可同时检测饲料及尿液中的克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，检出限均可达到3.0ng/mL。虽然酶联免疫法能检测上述样品中的克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等几种瘦肉精，但检测动物组织样品的结果常出现假阳性[9-10]，准确结果需用仪器法进一步确证。由于动物组织前处理较繁琐，ELISA 较少用于此类样品的检测。2
仪器检测前处理方法
仪器检测法主要有气相谱-质谱联用法（GC/MS ）、液相谱-质谱联用法（LC/MS ）等，样品的前处理步骤主要包括：水解、净化、洗脱，GC/MS 法的前处理还需对样品进行衍生化。2.1
样品的水解
因β-受体激动剂在芳香环结构
上均链接有烷羟基或羟基[11]，在动物体内的代谢大部分都与硫酸或葡萄糖醛酸发生作用，或者与之结合，生成的结合物水溶性很大，不溶于有机溶剂，因此样品的前处理必须先进行水解，再提取
游离态的目标化合物。较常用的水解方法有酶水解和酸水解两种[12-13]。酸水解通常使用无机酸，例如高氯酸[14]、盐酸[15]，较早的气相谱法、气-质联用法在样品的水解过程中均使用无机酸进行水解，其优点是快捷、简便、成本较低，但无机酸的作用强度往往较大，不易准确控制反应过程。改进后的气-质联用法、液-质联用法在样品水解过程中均使用β-葡萄糖醛苷酶取代无机酸进行水解处理，水解条件温和，一般不会引起待测物β-受体激动剂的分解，实验重现性较好，大幅度提高了方法的回收率。
2.2样品的净化液-液萃取法是经典的样品净化方法之一，早期Saniye等[16]对猪肝样品采用盐酸进行水解、乙酸乙酯作为提取液进行萃取；Kramer 等[17]对血浆样品采用100mmol/L硼酸溶液溶解，然后用乙腈溶剂进行萃取。单溶剂净化由于操作简单、使用设备少、成本低而被广泛使用，但该方法由于大量使用有害或有毒化学试剂，回收率不稳定，不适合基质复杂样品的提取和净化。针对基质复杂样品，国外一些研究人员采用不同配比的混合溶剂对萃取的方法进行改进，如Henze等[18]利用乙酸+乙
酸钠缓冲体系提供的酶解环境，在碱性条件下使用叔丁基甲醚+叔丁醇两种混合溶剂对尿样进行萃取。改进后的多溶剂混合萃取，克服了单一溶剂萃取的主要缺点，取得了显著的效果。近年来，随着分析技术的发展，气-质联用法、液-质联用法检测β-受体激动剂的前处理方法中引进了固相萃取技术（SPE），SPE被认为是一种对分离和净化都非常有效的样品前处理手段[19]，使用SPE能有效地避免液-液萃取过程中由于受基质干扰产生的乳化现象和萃取不完全的影响导致的回收率低下或不稳定，同时克服了因有机溶剂消耗大而产生大量废液的问题[20]。此外，SPE相对于液-液萃取操作更为简便，同时达到净化和浓缩样品的效果[21]。贺利民等[22]对饲料及肉类组织中的克伦特罗用强阳离子小柱（SCX）净化后进行分析，孟娟等[23]用中性阳离子小柱（MCX）进行前处理净化后测定了8种β-受体激动剂，单吉浩等[24]用酸性氧化铝小柱净化处理动物组织后测定克伦特罗，尚红霞等[25]采用XAD-2树脂处理、净化饲料样品并测定了其中的克伦特罗及沙丁胺醇。以上采用固相萃取小柱进行样品前处理的方法均取得了满意的检测效果。为了进一步提高分离和净化
效率，使用复合填料或串联2支（或2种）以上小柱的方法也已有报道，吴平谷等[26]对肉类组织、尿样中的克伦特罗等多种β-受体激动剂采用复合填料Cle-SLX小柱进行净化处理，实验回收率均达到了89.4%～98.7%，朱坚等[27]采用了碳十八与强阳离子小柱串联法对肉类动物组织进行净化处理，均取得较满意的效果。
2.3样品的洗脱洗脱阶段是仪器检测法样品前处理过程的关键步骤，常用的方法大多使用氨化有机溶剂
进行洗脱。结构分析表明，苯胺型的克伦特罗、苯酚型的沙丁胺醇、苯二酚型的莱克多巴胺3种β-受体激动剂的分子结构中都存在氨基和羟基，具有酸碱两性基团，故在选择洗脱液时，常用氨化甲醇（需适当调节pH）或用异丙醇等带羟基的试剂。常用的洗脱液分别有4%氨化甲醇、4%氨化乙酸乙酯和5%氨化乙酸乙酯等。如朱宝平等[28]采用含5%氨水的乙醇溶液进行洗脱，洗脱效果尚可，但浓缩时容易出现浑浊，影响回收效果，需二次离心。谢劲心等[29]采用甲醇+异丙醇+氨水进行洗脱，洗脱剂用量少，洗脱效果理想，但洗脱剂的配备过程相对繁琐，仍有进一步改进的空间。2.4衍生化处理由于β-受体激动剂含有羟基、氨基等极性基团，沸点高、难挥发，因此，GC-MS法常采用衍生化试剂来改变样品的活性基团，使之生成极性低、可汽化的衍生待测物，然后通过待测物的定量检测来计算目标化合物的含量。常用的衍生化试剂主要有99%的双三甲基硅烷基三氟乙酰胺（BSTFA）和1%的三甲基氯硅烷（TMCS）混合液。BSTFA衍生化试剂具有选择性高、反应速度快等优点，在食品、环境检测领域应用广泛[30]，而TMCS则作为常用的衍生化催化剂使用。有报道单独使用BSTFA进行样品衍生化时，可避免因氢氧键作用而产生的吸附，从而改善峰型，提高灵敏度和分离效率[31]，但添加少量TMCS能提高衍生化效率。以最常见的瘦肉精克伦特罗为例，衍生化前原化合物存在一个羟基，衍生化后羟基的活性氢被硅烷基团取代，生成了弱极性、易挥发的硅烷化衍生物，更容易被仪器检测出来，反应前后化合物结构式见图1、图2。因此，进样前如果不进行衍生化处理，高浓度标准溶液中的目标化合物在GC-MS上的响应值极低，实际检测的意义不大。衍生化过程中试剂若遇水会失效，导致衍生化失败，故氮吹及衍生化时应先去除水分。
2.5GC-MS 与LC-MS 的前处理方法比较
目前
气-质联用法的前处理方法为在pH 5.2的乙酸钠－醋酸缓冲液环境下加入β-盐酸葡萄糖醛甙酶进行酶解及提取，提取液经SLS 固相萃取柱净化，99%的双三甲基硅烷基三氟乙酰胺（BSTFA ）＋1%的三甲基氯硅烷（TMCS ）衍生，气相谱-质谱仪分析测定，内标法定量。该方法对莱克多巴胺、沙丁胺醇、克伦特罗这3种受体激动剂的检出限均可达到0.5μg/kg，早期曾作为β-受体激动剂的第一检测方法。LC-MS 法前处理方法同样是在pH5.2的乙酸钠－醋酸缓冲液环境下加入β-盐酸葡萄糖醛甙酶进行酶解及提取，提取液经MCX 阳离子交换柱净化，液相谱-质谱仪进行分析测定，内标法定量。该方法对沙丁胺醇等16种受体激动剂检出限均可达到0.1μg/kg。LC-MS 法与GC-MS 法的最大区别在于：GC-MS 法需对洗脱净化液进行衍生化处理，过程繁杂、耗时，衍生化不完全会导致回收率低下甚至实验失败；而LC-MS 法无需衍生化即可直接测定洗脱净化液中的多种目标化合物，且检测灵敏度更高，检测效率和实用性相对GC-MS 法具有明显优势。随着液-质联用技术的不断发展，新一代三重四极杆串联质谱（HPLC-MS/MS ）具有更高分辨率和更宽线性范围的定性、定量优势，同时兼备更强的抗杂质干扰能力，一次
进样可同时直接测定20多种β-受体激动剂，因此，HPLC-MS/MS 法目前已成为瘦肉精国家标准检测方法的第一法。
笔者在GC-MS 法样品前处理方法的研究中，对酶解时间、酶解温度、酶解液pH 进行了单个或多个影响因素的正交试验，通过对实验结果进行分析，得出的最佳实验条件为：酶解时间8小时、
酶解温度35℃、酶解液pH 2.0，最后采用4%氨化乙酸乙酯进行洗脱。在满足同样检测要求的前提下，此条件相对于标准方法，缩短了酶解时间，简化了提取步骤，优化和调整了实验条件，可应用于大批量样品的检测。3
展望
随着谱-质谱联用技术的不断发展，瘦肉精检测方法GC-MS 法和LC-MS 法将得到不断的完善和进一步的推广普及，同时随着分离净化手段和设备的不断更新，瘦肉精的前处理方法将向着多组分、高灵敏度、高选择性、高效率的方向发展。
参考文献
[1]姚惠铭.两起由疑似“瘦肉精”中毒引起的食物中毒的调查分析[J].职业与健康，2001，17（9）：51-52.[2]
贺铁明，胥传来，王武康，等.盐酸克伦特罗免疫原的合成与鉴定[J].中国粮油学报，2004，19（2）：85-87.[3]Antignac JP,Marchand P ,Le BB ,et al.Identification of rac-topamine residues in tissue and u
rine samples at ul-tra-trace level using liquid chromatography-positive elec-trospray tandem mass spectrometry[J].Chromatogra B Ana-lyt Technol Biomed Life Sci,2002,774(1):59-66.[4]Lehner AF,Hughes CG,Harkins JD,et al .Detection and
identification of dizocilpine and its major urinary metabo-lites in the horse:a preliminary report.[J].Chromatographia,2004,59(S1):S95-S103.[5]
瘦肉精检测卡
高燕红，吴西梅.液质联用快速测定饲料中的莱克多巴胺和克仑特罗[J].中国卫生检验杂志，2005，15（6）：143-145.
[6]Bocca B,DiMattia M ,Carton C,et al.Extraction,clean-up
and gas chromatography-mass spectrometry characteriza-tion of zilpaterol as feed additive in fattening cattle[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2003,783(1):141-149.
[7]Hagedore HW,Zuek S,Sehulz R.Detection of CL in the horse
[J].J Vet Med Serie A,1995,42(3):209-219.[8]
罗晓琴，张丽洁，尚朋朋，等.放心肉的“试金石”—瘦肉精快速检测三联卡[J].农产品加工，2012，
4：
图1
克伦特罗标准结构与质谱图
图2克伦特罗衍生物结构与质谱图
应用预防医学2018年8月第24卷第4期Applied Prev Med,August2018,Vol24No.4
11-12.
[9]Ancelettiz R,Qiundi MP,Oiro R,et al.Application of an en-
喷香器zyme-linked immunosorbent assay kit forβ-agonists screening of bovine urunes in north-eastern Italy[J].Analyyt-ica Chimica Acta,1993,275(1-2):215-219.
[10]胡小钟，倪澜荪，余建新，等.酶联免疫吸附分析方法
检测克伦特罗时假阳性问题的探讨[J].中国畜牧杂志，2000，36（5）：24-25.
[11]王炼，黎源倩.β2-兴奋剂类药物的分析进展[J].中国卫
生检验杂志，2006，16（12）：1540-1542.
[12]Robards K,Towers P.Chromatography as a reference tech-
nique for the determination of clinically important steroids [J].Biomed Chromatogr,BMC,1990,4(1):1-19.
[13]Kabra PM.Clinical analysis of individual steroid by column
liquid chromatography[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,1998,429:155-176.
[14]杨成对，宋莉晖.动物组织中克伦特罗残留的定性分析[J].
分析化学,2005,33(2):286.
[15]Lamparczyk H,Zarzyck PK,Nowakowska J,et al.Application
仿皮绒
of beta-cyclodextrin for the analysis of estrogenic steroids in human urine by high-performance liquid chromatography [J].Chromatographia,1994,38:168-172.
[16]Keskin S,Oezer D,Temize A.Gas chromatography-mass
spectrometric analysis of clenbuterol fromurine[J].J Pharm Biomed Anal,1998,18(4-5):639-644.
[17]Kramer S,Blaschke G.High-performance liquid chromato-
graphic determination of theβ2-selective adrenergic ago-nist fenoterol in human plasma after fluorescence derivation [J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2001, 751:169-175.
医用手套
[18]Henze MK,Opfermann G,Spahn-langguth,et al.Screening of
igbt散热
β2-agonists and confirmation of fenotero,lorciprenaline, reproterol and terbutaline with gas chromatography-mass spectrometry as tetra-hydro is oquinoline derivatives[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2001,751: 93-105.
[19]黄路，张勇民，郑琦.SPE-HPLC法检测食品中多种痕
量雌激素[J].2014，42（1）:55-58.
[20]刘欣平，张亚东.药物残留检测样品前处理技术进展
[J].职业与健康，2008，24(5):484-485.
[21]康莉，仲岳桐，陈春晓，等.固相萃取-高效液相谱
法测定肉中盐酸克伦特罗[J].中国卫生检验杂志，2003，13(1):53-54.
[22]贺利民，苏贻娟，张嘉慧.气相谱-质谱法测定动物
组织及饲料中克伦特罗[J].质谱学报，2005，26（3）：168-172.
[23]孟娟，邵兵，吴国华，等.气相谱-质谱法同时测定
动物性食品中8种β2-兴奋剂的残留量[J].中国卫生检验杂志，2005，15（6）：641-642.
[24]单吉浩，刘素英，王海.高效液相谱-质谱法测定猪
四种可食性组织中克伦特罗残留量的研究[J].质量监督与检验，2005，（1）：36-38.
[25]尚红霞，卢业玉，黄宝华.固相萃取-高效液相谱法
同时测定克伦特罗和沙丁胺醇[J].分析科学学报，2003，19（2）：145-147.
[26]吴平谷.生物材料中克伦特罗的气相谱-质谱法测定
[J].分析测试学报，2002，21（1）：19.
[27]朱坚，李波，方晓明.气相谱-质谱法测定肝、肾和
肉中11种β2-受体激动剂残留量[J].质谱学报，2005，26（3）：129-137.
[28]朱宝平，骆和东，陈恺玲，等.GC-MS/MS法测定动物
性食品中的克伦特罗残留量[J].海峡预防医学杂志，2006，12（3）：8-11.
[29]谢劲心，林斯星.气质联用法同时检测尿及组织中的克
仑特罗和莱克多巴胺残留[J].中国卫生检验杂志，2010，20（8）：1864-1866.
[30]罗夏琳，李攻科，胡玉斐.衍生化技术在食品安全谱
分析中的应用[J].中国科学化学，2016，46（3）：243-250.谷氨酸发酵
[31]Hernandez-Carrasquilla M.Gas chromatography-mass spec-
trometry analysis ofβ2-agonists in bovine retina[J].Anal chim Acta,2000,408:285-290.
收稿日期：2018-03-05编辑：黄勇俐
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议