5.1 细胞融合的概述
5.2 细胞融合技术的意义
5.3 细胞融合的基本原理
5.4 细胞融合材料
5.5 细胞融合的方法
5.6 融合细胞的筛选
5.7 细胞融合技术的应用举例
5.8 展望
5.1 细胞融合的概述
5.1.1 细胞融合的定义
细胞融合（Cell fusion）又称体细胞杂交（Somatic hybridization）：是指将不同来源的细胞或原生质体通过人工方法诱导融合形成细胞，并使之分化再生，形成新物种或新品种的技术。 5.1.2 细胞融合的类型石榴套袋技术
根据所选用的亲本细胞或原生质的来源可分为以下4种：
体细胞杂交
1、利用双亲的体细胞或原生质进行融合，是真正意义上的细胞融合技术，目前细胞融合的大多数组合仍以体细胞杂交为主。
2、配子-体细胞杂交
融合亲本一个为体细胞，另一个为性细胞（精、卵细胞），可获得三倍体细胞。
3、配子间细胞杂交
融合双亲本均为性细胞（精、卵细胞），配子间细胞杂交有多种组合形式。其中以精、卵细胞进展最快。例如：玉米
4、微细胞杂交
先诱导细胞中形成高频率的微核，再分离和制备具有此微核的细胞或原生质体，作为融合的亲本而进行体细胞杂交。
用于转移单个完整的染体以建立单体或多体的“染体”。
5.2 细胞融合技术的意义
可以避开生殖细胞的受精过程，在亲缘更远的物种间实现基因转移，创造出自然界中所没有的新物种。
体细胞融合还有一个重要的价值，就是创造细胞质。
体细胞杂交在作物育种和种质创新上有其独到的意义和作用。
5.3 细胞融合的基本原理
将来自小鼠和人体的两个细胞通过细胞融合技术，得到含有两者遗传信息的新的杂合细胞，然后通过培养基筛选出这种杂合细胞，就有可能得到一个新生物。
细胞融合的研究历史
细胞融合现象最初是在动物细胞中表现的。 1858年Virchow叙述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞情况。
1875年，Lange第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生的合并现象。
1962年日本冈田善雄发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。
1965年英国海利斯等发现当HVJ被吸附在两个细胞表面后，相互接触而引起细胞膜之间出现所谓细胞桥的结构（见图4.2），随着时间的推移，细胞桥的数量和体积增加，最后细胞质融合为一个双核的细胞或多核细胞。
20世纪七十年代初，华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合，开拓了植物细胞融合的研究。
后来细胞融合技术逐步扩展到植物细胞和微生物细胞。细胞融合现已成为细胞工程的核心技术之一。
5.4 细胞融合材料
植物或微生物原生质体的制备
动物单个细胞的获得
5.4.1植物或微生物原生质体的制备
为了促使细胞融合就必须先得到单个细胞，除去细胞壁，才能获得植物原生质体或微生物原生质球。
因此，对于植物和微生物细胞的融合一般称为原生质融合仙台病毒
原生质体内包裹着细胞核、细胞器、细胞质等生命活性物质，因此它是裸露的、具有生命活性的细胞。它具有再生细胞壁、进行连续分裂并生成完整植株的能力，即具有细胞全能性。原生质体能摄取如DNA吸湿剂、质粒、病毒、细菌、细胞器等外源物质，是植物细胞工程进
行遗传操作、基因转移的良好材料。
去掉细胞壁的原生质体在一定条件下能克服不同种细胞间的不亲和障碍，为细胞杂交提供融合亲本，培育新品种。
具体操作：
1960年，英国诺丁汉大学的科金（E.C.Cocking）第一次用酶解法成功地大量制备出原生质体 。
取材消毒
取鲜嫩的植物组织，水洗后用70%的酒精浸泡1分钟，再放入8%次氯酸钠浸泡1分钟，无菌蒸馏水洗3－4次（以下过程全部无菌操作）。
酶解制备
撕去下表皮，剪成1mm2大小，然后在25－28恒温水浴内酶解60－90分钟。
原生质体收集
用300－400目不锈钢网过滤酶解材料，弃去残渣，600r/min离心分钟，原生质体沉降后，吸去上清液，将原生质体悬浮在0.16mol/L CaCl2·2H2O溶液中，在容器底部缓慢注入20%蔗糖溶液，同样速度离心10分钟，两液面之间是纯净的原生质体带，收集备用。
5.4.2 动物单个细胞的获得
动物细胞虽然没有细胞壁，但细胞间的连接方式多样而复杂，在进行有效的细胞融合之前，也必需获得单个分散的细胞。
组织的获得：
采用各种适宜的方法处死动物，取出组织块放入小烧杯中，用剪刀将组织块剪碎成1mm3大小，用吸管吸取Hanks溶液冲下剪刀上的碎块，补加3－5ml的Hanks溶液，用吸管轻轻吸打，低速离心，弃去上清液，留下组织块。
组织的消化：
通过生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。根据不同的组织对象采用不
同的酶消化液。如最常用的有胰蛋白酶和胶原酶等。其他的酶如链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等也可用于动物细胞的消化。EDTA最适合消化传代细胞，常与胰蛋白酶使用。
胶原酶消化：
是一种由细菌中提取的酶，对胶原和细胞间质有较强的消化作用，适用于消化纤维组织、上皮组织、癌组织等。
（1）向培养瓶中放入1－5mm3大小的组织块，加5ml2000单位/ml的胶原酶干液，最终浓度为200单位/ml，pH=6.5。
（2）36.5℃水浴4－48小时，无需摇动，中间可更换酶液一次。
（3）当组织变软，分散于瓶底时，轻轻震荡即散成细胞团或单个细胞，小心倒出培养液。
（4）800r/min离心5分钟，弃上清液，重新悬浮BSS溶液中，再离心一次。
（5）加入培养液制成细胞悬浮液。
5.5 细胞融合的方法
生物法
化学法
物理法
方法选择
融合细胞的影响因素
5.5.1 生物法—絮凝沉淀池仙台病毒法
各种病毒都具有凝集细胞的能力，它一边粘接在一个细胞表面，另外一边粘接在另一个细胞表面，从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。
用于促细胞融合的病毒：
DNA病毒：疱疹病毒、痘病毒、
RNA病毒：仙台病毒、麻疹病毒、呼吸道 合胞病毒、新城鸡瘟病毒、致瘤病毒、日冕病毒
仙台病毒法
最早用于动物细胞融合的融合剂，低毒，对人的危害小、成为实验室广泛采用的动物细胞融合剂。
病毒促使细胞融合的主要步骤：
两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近。
通过病毒与原生质体或细胞膜的相互作用使两个细胞膜间互相渗透胞质互相渗透。
两个原生质体的细胞核互相融合为一体。
进入正常的细胞分裂途径，分裂成 含有两种染体的 子细胞。
5.5.2 化学法
5.5.2.1 化学融合法的类型
盐类融合法：盐类融合剂如下
硝酸盐类：NaNO3 、KNO3 、Ca（NO3 ）2
氯化物类：NaCl、CaCl2、MgCl2
葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠
高Ca2+和高pH融合法
PEG融合法：加拿大华人 高国楠 提出的
高电动液控闸阀Ca2+和高pH与PEG相结合融合法
5.5.2.2 PEG融合法基本原理
聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)是一种多聚化合物，分子式为tt277H(OHCH2-CH2)nOH，商品名卡波蜡(Carbowax)。实验室用的PEG平均分子量在200－20000之间，一般1000以下者为液体，1000以上者为固体。
这种多聚化合物靠醚键的联结使其分子末端带有弱电荷。
机理初步分析可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高Ca2+和pH溶液的作用下，将与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。
5.5.2.3 PEG融合法基本过程
5.5.3 物理法—电融合诱导法
主要包括显微操作、电场刺激等。
5.5.3.1 基本原理
在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。
电融合诱导法的优点
融合率高、重复性强、对原生质体伤害小；装置精巧、方便简单、可在显微镜下观察或录
像融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等等。
5.5.3.2 基本过程
电融合装置的电极有两种：微电极型和平行多电极型
具体操作步骤如下：
5.5.4 方法选择
具体应用时要根据不同对象选择不同的细胞融合方法和条件。
动物细胞融合：仙台病毒HVJ诱导法、 PEG法、电融合法都适用。
植物细胞融合：常用PEG法和电融合法
微生物细胞融合：只适用PEG法
5.5.5 融合细胞的影响因素
植物细胞融合
动物细胞融合
5.6 融合细胞的筛选
根据参与融合的两个细胞之间的亲源关系，融合细胞类型如下：
同核体细胞
同种细胞自身的融合体。
异核体细胞（细胞）
非同种细胞的融合体。亲缘关系较近
多核体细胞（细胞）
含有双亲不同比例核物质的融合体。亲缘关系较远
5.6 融合细胞的筛选
两种不同细胞融合过程中，往往可以形成
五种不同的细胞：（例如：脾细胞与骨髓瘤细胞之间的融合）
未融合的细胞（两种）
同核体细胞（两种）
异核体细胞（细胞）
筛选的必要性:
为了从融合后的细胞中选育目的细胞必须采用合适的筛选方法。
5.6 融合细胞的筛选
融合细胞的筛选方法如下：
遗传互补筛选法
抗性互补筛选法
生长特性筛选法（选择性培养基筛选法）
物理特性筛选法
荧光素人工标记筛选法
Jongkind等用发红、绿荧光的聚乙烯颗粒标记分别培养的人成纤维细胞，融合24h后红绿杂合荧光的细胞用荧光活化细胞分类仪分离。
5.6 融合细胞的筛选
HAT选择系统（选择性培养基筛选法）
利用酶缺失型细胞株（次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶‘HGPRT’缺失型细胞株）为一方和另一种细胞进行融合，然后使用HAT（细胞培养液中含次黄嘌呤 H；氨基碟呤 A ；嘧啶核苷酸 T）选择性培养基系统分离细胞。
这一典型的方法是Littlefield于1964年建立的。此法使细胞的克隆技术成为实验室常规操作，利用HAT选择性培养基和突变细胞株解决了分离杂交瘤细胞的困难。
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