王惠;郭峰;关超;张梅;关萍;白洪志
【摘 要】以鸡红细胞、兔红细胞、蟾蜍红细胞作为同源与异源研究的试验材料,聚乙二醇作为促融剂,从聚乙二醇不同浓度、融合温度、融合时间三个方面进行单因素探究,以期到融合率最高的条件.结果表明,蟾蜍同源红细胞融合组的最适条件为聚乙二醇500 mL/L、37℃、10 min,其余组最适条件皆为聚乙二醇500mL/L、37℃、15 min,且通过对数据的分析发现,融合温度与融合时间对细胞融合率的影响远小于聚乙二醇浓度的影响.此外,由于球形的兔红细胞在运动时所受到的阻力明显小于椭球形的鸡红细胞和蟾蜍红细胞,使得兔同源红细胞的融合率及与兔红细胞融合的异源红细胞的融合率比其他组都高,其中兔同源红细胞最高融合率达到39.3％,而蟾蜍红细胞由于体型远大于其余两类红细胞,其融合率也相应较大. 【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2012(033)012
湿法炼锌【总页数】4页(P145-148)
【关键词】聚乙二醇;红细胞;细胞融合;融合率
【作 者】王惠;郭峰;关超;张梅;关萍;白洪志
【作者单位】沈阳农业大学土地与环境学院,辽宁沈阳110866
【正文语种】中 文
【中图分类】Q32
细胞融合（cell fusion），又称细胞杂交，是指在外力的作用下2个或2个以上的细胞融合成一个双核或多核细胞的现象，因此又称细胞杂交。细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒、肿瘤和培育生物新品种的重要手段［1-3］，尤其是近年来发展起来的新研究技术有着更为重大的实践意义［4-7］。细胞融合的方法包括仙台病毒诱导法、物理融合技术（电融合技术）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）法等。其中PEG法诱导细胞融合以其容易制备、活性稳定、不需要特别的仪器设备、操作方便等优点，被普遍用于生物、遗传、医药等研究领域［8-9］。但 该 方 法 也 受 许 多 因 素 的 影 响［10-15］，如PEG浓度、融合温度、融合时间等。
本试验选取鸡红细胞、兔红细胞、蟾蜍红细胞作为同源与异源细胞研究的试验材料，从PEG浓度、融合温度、融合时间三个方面进行单因素探索，以期到融合率最高时的条件，达到更好的融合效果。
1 材料与方法
a-ga
1.1 材料
1.1.1 试剂 不同浓度的PEG（Mr=4 000）：250、500、750mL／L PEG；380g／L柠檬酸钠；8.5g／L生理盐水；GKN液；Hanks液；750mL／L酒精。
1.1.2 仪器 电子天平，恒温水浴锅，低速离心机，微量移液，光学显微镜。
1.2 方法
1.2.1 不同浓度PEG的配制 称取少许PEG（Mr=4 000）放入小烧杯中，沸水浴加热，使其熔化，分别移取等量的3份至刻度试管中，待冷至50℃时，分别加入预热的3倍体积、1倍体积、1／3体积的GKN液，混匀，配成250、500、750mL／L的PEG。
仙台病毒1.2.2 红细胞的采取及细胞悬液的制备 用灭菌的注射器吸入38g／L的柠檬酸钠2mL，从用750 mL／L酒精消过毒的鸡翼静脉处（兔是从耳缘静脉处，蟾蜍是从主动脉弓处）采取静脉血转入事先装有38g／L的柠檬酸钠的烧杯中使柠檬酸钠与血液的体积比为1∶4，放入4℃冰箱中保存。
取悬液1mL移入10mL的刻度离心管内，加入8.5g／L生理盐水4mL混匀，1 500r／min离心5 min；弃上清液（用吸管吸去），加8.5g／L生理盐水至5mL，混匀后1 500r／min再离心5min；重复上述操作，再离心洗涤1次；收集最后一次离心沉淀的红细胞，用手指轻弹底壁使沉淀松散［9］。用微量移液器移取细胞沉淀至干净试管中，加入9倍体积的GKN液，配成100mL／L的细胞悬液。
1.2.3 细胞融合的方法 试验分6组进行，同源3组，异源3组，分别为鸡-鸡、兔-兔、蟾蜍-蟾蜍、鸡-兔、鸡-蟾蜍和兔-蟾蜍的红细胞融合，每组10只试管进行单因素试验，筛选出每组融合的最佳条件。
1.2.3.1 PEG浓度对同源、异源红细胞融合最适条件的探索 分别取红细胞悬液200μL（同源组取200μL，异源组则分别取异源的两种红细胞各100 μL）至3个刻度离心管中，分别加入
压纸机预热的100μL的250、500、750mL／L的PEG，放于37℃水浴锅内温浴5min后，再分别加入Hank＇s液5mL，静置2 min以终止PEG的作用；用微量移液器移取少量红细胞悬液至血球计数板上，盖上盖玻片，观察红细胞融合情况。
1.2.3.2 融合时间对同源、异源红细胞融合最适条件的探索 分别取红细胞悬液200μL（同1.2.3.1）至3个刻度离心管中，分别加入预热的100μL上一项试验中融合率最高时的PEG，放于37℃水浴锅内温浴5、10、15min后，再分别加入 Hank＇s液5 mL，终止PEG的作用，观察红细胞融合情况。
1.2.3.3 融合温度对同源、异源红细胞融合最适条件的探究 分别取红细胞悬液200μL（同1.2.3.1）至3个刻度离心管中，分别加入预热的100μL上一项试验中融合率最高时的PEG，分别放于23℃、30℃、37℃、44℃水浴锅内温浴上一项试验中测得的融合率最高时的融合时间，再分别加入Hank＇s液5 mL，终止PEG的作用，观察红细胞融合情况。
1.2.4 细胞融合率的计算 在显微镜视野里，每个视野下读取计数板中间大方格中四角中方格及中心中方格中融合的细胞及未融合的细胞数（注意区分融合细胞与重叠细胞［16］），用下面的公式计算每方格内的融合率，取平均值。
耐热粘合剂融合率=融合的细胞数／总细胞数×100%［17］
2 结果
2.1 PEG介导的红细胞融合的最适条件探索
2.1.1 PEG浓度对同源、异源红细胞融合最适条件的探索 在37℃、5min融合时间处理条件下，各种类型同源、异源红细胞融合时，PEG为250mL／L的融合率最低，PEG为750mL／L的融合率次之，PEG为500mL／L的融合率最高，其中，同源红细胞融合中，以兔同源红细胞融合率最高为37.8%，异源红细胞融合中，以兔-蟾蜍异源红细胞融合率最高为11.1%（表1）。
表1 不同浓度PEG同源、异源红细胞融合率Table 1 Cell fusion rates of isogenous，heterogenous erythrocytes in different PEG concentrations %浓度／（mL·L-1）Concentration鸡同源Chicken isogenous erythrocytes兔同源Rabbit isogenous erythrocytes蟾蜍同源Road isogenous erythrocytes鸡-兔异源Chicken-rabbit heterogenous erythrocytes鸡-蟾蜍异源Chicken-toad heterogenous erythrocytes兔-蟾蜍异源Rabbit-road
heterogenous erythrocytes 250 2.1 18.1 5.5 7.5 2.5 4.4 500 5.4 37.8 8.7 9.1 6.0 11.1 750 4.5 22.7 7.1 8.9 4.1 9.5
2.1.2 融合时间对同源、异源红细胞融合最适条件的探究 在PEG 500mL／L、37℃处理条件下，各种类型同源、异源红细胞融合时，融合时间5min的融合率最低，10min的融合率次之，15min的融合率最高（蟾蜍例外，在10min融合率最高）。其中，同源红细胞融合时，以兔同源红细胞融合率最高为38.2%，异源红细胞融合中，以兔-蟾蜍异源红细胞融合率最高为12.7%（表2）。
表2 不同融合时间同源、异源红细胞融合率Table 2 Cell fusion rates of isogenous，heterogenous erythrocytes in different response time %时间／min Time鸡同源Chicken isogenous erythrocytes兔同源Rabbit isogenous erythrocytes蟾蜍同源Road isogenous erythrocytes鸡-兔异源Chicken-rabbit heterogenous erythrocytes鸡-蟾蜍异源Chicken-toad heterogenous erythrocytes兔-蟾蜍异源Rabbit-road heterogenous erythrocytes 5 5.4 37.8 8.7 9.1 6.0 11.1 10 6.1 38.0 10.8 9.7 6.1 12.5 15 6.2 38.2 8.9 10.2 6.2 12.7
2.1.3 融合温度对同源、异源红细胞融合最适条件的探究 在融合时间15min、PEG 500mL
／L条件下，各种类型同源、异源红细胞融合时，融合温度23℃的融合率最低，30℃的融合率次之，37℃的融合率最高，温度升高至44℃时，融合率反而下降。其中，同源红细胞融合时，以兔同源红细胞融合率最高为39.3%，异源红细胞融合时，以兔-蟾蜍异源红细胞融合率最高为14.0%（表3）。
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