Nature陈志坚团队首次系统性揭示cGAS-STING在细胞自噬中的功能

来源：BioArt

先天免疫通路是机体防御外来病原体感染的第一道防线，主要包括Toll样受体通路(Toll-like receptors, TLRs)、RIG-I样受体通路(RIG-Ilike receptors, RLRs)、Nod样受体通路(Nod-like receptors, NLRs)及DNA受体通路,这些受体介导1型干扰素及炎性细胞因子的产生。cGAS-STING通路是新近鉴定出来的DNA受体通路。鸟嘌呤腺嘌呤(CyclicGMP-AMP, 简称为cGAMP)合酶cGAS通过结合自身损伤的DNA或者外源病原体DNA,合成第二信使cGAMP, cGAMP与接头蛋白STING结合并活化STING,进一步激活TBK1，诱导转录因子IRF3和NF-kB入核，产生1型干扰素和细胞因子。

最近的研究表明，cGAS-STING通路的激活与细胞自噬密切相关。在DNA刺激后，STING蛋白与自噬标志物LC3部分共定位【1】。cGAS与Beclin-1通过相互作用促进自噬的发生。这种相互作用抑制cGAS催化活性，从而负反馈调节cGAS-STING通路，以防止该通路的过度免疫激活【2】。同时，STING的Ser-366位点被自噬相关激酶ULK1磷酸化，从而导致STING通过自噬降解【3】。然而这个模型受到挑战，STING上的Ser-366突变为Ala不会影

响其降解，而是丧失其激活IRF3的能力【4,5】。因此，cGAS-STING通路如何与自噬的发生的机制还有待进一步的探索。

2019年3月7日，德克萨斯大学西南医学中心陈志坚（Zhijian James Chen）团队在Nature上发表了题为Autophagy induction via STING trafficking is a primordial function of the cGAS pathway的文章（今日Nature上发表的第三篇来自陈志坚教授团队的工作），首次系统性揭示了cGAS-STING通路在细胞自噬中的功能。

研究人员发现，使用ISD(interferon stimulatory DNA)，HT-DNA，cGAMP,HSV处理BJ细胞（人皮肤成纤维细胞），都能引起LC3被酯化生成LC3-II（细胞自噬的标志）、GFP-LC3点状聚集，诱导自噬的发生。作为对照，作者发现Poly（I:C）（双链RNA类似物，模拟RNA病毒感染）和Sendaivirus (SeV，仙台病毒为RNA病毒)不能引起细胞自噬现象。进一

步，通过基因敲除实验发现，DNA刺激引起的细胞自噬依赖于cGAS、STING。

STING 的CTT结构域对于其诱导干扰素功能是必须的。TBK1通过磷酸化STING的S366位点，激活STING通路，产生干扰素。通过TBK1敲除细胞或使用TBK1抑制剂，cGAMP刺激不能激活IRF3，但是仍然能够诱导LC3的酯化。STING的S366A突变体或者STING缺失CTT结构域的变体，也不能激活IRF3，但是依然可以激活自噬。这些结果表明，cGAMP诱导的细胞自噬，不依赖TBK1，是独立于TBK1-IRF3的一个新功能。

进一步，作者通过序列比对分析发现，在低等生物中，STING蛋白是缺乏CTT结构域（下图），比如N. vectensis（海葵，一种长在水中的低等食肉动物） STING和Xenopus（非洲爪蟾） STING。试验表明，cGAMP刺激可以激活彩钢板屋顶N. vectensis STING和红黑电源隔离插座Xenopus电极臂 STING，诱导细胞自噬，但是没有激活TBK1-IRF3。这个结果表明，cGAMP诱导的细胞自噬是cGAS-STING通路一个原始的功能。

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上图来自文献【6】

STING通路的激活过程，起始于STING从内质网向内质网–高尔基体中间区(ERGolgi intermediate compartment, ERGIC)，再到Golgi的转运过程。使用ER-Golgi转运抑制剂BFA或者GCA，可以同时抑制IRF3的激活和细胞自噬。敲除COPII家族的蛋白，显著抑制cGAMP诱导的TBK1-IRF3激活和细胞自噬。这些结果表明，STING的膜转运过程是激活其下游信号通路的重要步骤。

作者在研究STING转运过程中发现，cGAMP刺激能够引起STING与ERGIC-53（ERGIC标记物）共定位。来自Schekman的研究发现，在饥饿有诱导的LC3酯化反应中，ERGIC是主要膜提供者【7】。作者设计了一个生化实验，检测cGAMP诱导的LC酯化是否需要ERGIC来源的膜。作者使用ATG5敲除的293T细胞作为膜的提供者。在饥饿刺激ATG5敲除的293T细胞后，分离P25的膜组分。当这个组分与野生型细胞的细胞质组分（S100）孵育时，LC3发生酯化反应。重要的是，当使用cGAS刺激细胞后，使用P25的膜组分与S100孵育后，LC3也发生明显的酯化反应。相反，在使用BFA处理的细胞中，其膜组分P25不能诱导LC3的酯化反应。作者使用蔗糖梯度超速离心和Opti-Prep(iodixanol)密度梯度超速离心

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进一步分离膜组分，结果发现，在富集ERGIC53和SEC22b的ERGIC组分中，LC3出现显著的酯化反应。这些结果直接表明，在cGAMP诱导的LC3酯化反应中，ERGIC是主要的膜提供者。进一步，通过CRISPR技术，作者发现，cGAMP诱导的细胞自噬依赖于WIP2和ATG5，不依赖于经典的自噬相关基因，例如：ATG9，Beclin，ULK1/2。这表明，cGAMP诱导的细胞自噬是一个有别于经典自噬的全新功能。

作者最后通过活细胞成像技术发现，cGAMP刺激可以减少细胞内转染的DNA和损伤DNA的积累。作者发现，cGAMP刺激缺失CTT结构域的STING细胞中，HSV、HIV病毒滴度明显降低。通过基因敲除实验发现，病毒清除功能依赖于ATG5，不依赖于Beclin1和TBK1。来自Legionella蛋白RavZ，可以从膜结构上剪切LC3，从而抑制自噬过程【8】。在293T-STING细胞中，cGAMP处理可以降低细胞内病毒滴度。在使用高浓度野生型的RavZ蛋白处理后的细胞中，cGAMP不能清除病毒，相反，使用突变型的RavZ蛋白处理的细胞中，cGAMP则可以显著降低细胞内病毒滴度。综合以上结果，cGAMP诱导的自噬在抗病毒过程中起着关键作用。仙台病毒

DNA通过cGAS-STING通路诱导自噬的模型。

总之，作者通过生化实验，细胞生物学和分子生物学等手段，揭示了细胞自噬是cGAS-STING一个古老而且重要的功能，而且这一功能不依赖TBK1-IRF3以及经典的自噬信号分子。机制上，揭示了STING的膜转运过程以及含有STING的ERGIC膜在cGAMP诱导的细

胞自噬过程中起着重要作用。功能上，这一细胞自噬在清除细胞内DNA和病毒发挥了重要作用。本文第一次系统性地揭示了DNA/cGAMP 诱导细胞自噬的分子机制与生物学功能。

据悉，桂翔博士和杨辉博士为本文共同第一作者，陈志坚教授为本文通讯作者。

针对此项研究，BioArt独家邮件采访了陈志坚教授。陈教授总结了该工作的意义，原文如下：Elucidatesthe mechanism by which STING induces autophagy, revealing that autophagy induction by STING is uncoupled from type-I interferon induction by STING, and that the autophagy induction is a primordial function that precedes interferon induction by STING during evolution.（阐明了STING诱导自噬的分子机制，并且发现该过程与STING诱导的I型干扰素诱导不相关。从在进化上来讲，STING诱导自噬的功能要先于诱导干扰素的功能出现。）

值得一提的是本文在投稿过程中，部分内容被下面三篇文章抢发。

1. Liu, D., et al. 'STING directly activates autophagy to tune the innate immune response.' Cell death and differentiation (2018).

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