【实验目的】
了解分子量、脂溶性大小、电解质和非电解质溶液对细胞膜透性的影响。 【实验原理】
细胞膜在不断变化的环境中，必须保持自身的稳恒状态，才能生存。细胞膜允许一些物质通透，又能降低甚至阻挡另一些物质的通透，所以细胞膜具有选择通透性。水分子可以自由通过细胞膜，当细胞处于低渗液环境时，水分子大量渗到细胞内，使细胞膨胀，进而破裂，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红透明的血红蛋白溶液，这就是溶血现象。 溶血现象可作为测量物质进入红血细胞速度的一种指标。 红细胞置于乙二醇、丙三醇（甘油）、葡萄糖等摩尔浓度的高渗液中，乙二醇等分子进入红血细胞，使细胞内的渗透性活性分子的浓度大为增加，继而导致水的摄入，使细胞膨胀，细胞膜破裂，发生溶血。溶血现象发生的快慢与进入细胞的物质的分子量大小有关。分子量大的进入细胞慢，发生溶血所需时间也长。
非极性化合物易溶于脂溶剂，但在水中溶解度甚小。碳链越长，脂溶性越大。一种化合物在脂溶剂中的溶解度与其在水中溶解度之比，叫分配系数。
各种非电解质溶液，只要单位面积中所含的分子数相同，就具有相同的渗透压。电解质溶液，如氯化钠与葡萄糖分子数相等时，氯化钠产生的渗透压要大的多。具有相同渗透压的某非电解溶液与某电解质溶液浓度之比，叫等渗系数。用ⅰ来表示。
ⅰ= 葡萄糖的等渗摩尔浓度/ 氯化钠的等渗摩尔浓度
发生溶血者为低渗液，所以把发生溶血的前一管溶液的浓度近似视为红细胞等渗。
【实验仪器、材料和试剂】
（一）仪器、用具
小烧杯、试管、试管架、刻度吸管、注射器、秒表
（二）材料
含适量肝素的兔血或鸡血
（三）试剂
1M乙二醇水溶液、1M丙三醇水溶液、1M葡萄糖水溶液、3M甲醇、3M乙醇、3M丙醇、M/8、M/9、M/10聚结器、M/12、M/14葡萄糖溶液、M/12、M/13、M/14、M/16、M/18氯化钠溶液
【方法与步骤】
（一）分子量大小对膜通透性的影响
1．在编号的三支试管中，分别用吸管吸入2ml 1M乙二醇，1M丙三醇，1M葡萄糖高渗液。
2．先后分别用注射器滴加两滴血液，用手指按住管口，倒置一次。
3．观察溶血时间，最长延至10min。
4．将实验结果列入如下所示的表格中。
溶液 | 分子量 | 溶血时间 |
1M乙二醇 | 62 | |
1M丙三醇 | 92 | |
摆度1M葡萄糖 | 180 | |
| | |
（二）脂溶性大小对细胞膜透性的影响
1．编号的三支试管分别加入2ml 3M的甲醇、乙醇、丙醇溶液。
2．分别先后加入两滴血液，按住管口倒置一次。
3．观察溶血时间。
4．将实验结果记入如下所示的表格中。
溶液 | 分子量 | 分配系数 | 溶血时间 |
3M甲醇 | 32.04 | 0.0097 | |
3M乙醇 | 46.07 | 0.0357 | |
3M丙醇 | 58.0 | 0.156 | |
| | | |
（三）电解质和非电解质溶液对细胞膜透性的影响
1．将试管编号，注明溶质名称及摩尔浓度。
2．按编号分别加入不同浓度的葡萄糖及氯化钠溶液 2ml。
3．每管各加入两滴血液，按住管口，倒置一次。
4．室温放置15min ，观察发生溶血的浓度，确定等渗浓度。
5．按下表记录实验结果。
溶液 | 摩尔浓度 |
M/8 | M/9 | M/10 | M/12 | M/13 | M/14 | M/16 | M/18 |
葡萄糖 | | | | | | | | |
氯化钠 | | | | | | | | |
| | | | | | | | |
6．计算等渗摩尔系数
【实验目的】
1．了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理。 2．通过PEG诱导鸡红细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。
【实验原理】
细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的细胞（hybrid cell）。细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。依据融合过程采用的助融剂的不同，细胞融合可分为：（1）病毒诱导的细胞融合，如：仙台病毒（hemagglutinating virus of Japan，HVJ）；（2）化学因子诱导的细胞融合，如：聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）；（3）电场诱导的细胞融合；（4）激光诱导的细胞融合。
PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子质量的多聚体。PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。该方法应用分子质量为400—6000的PEG溶液引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。融合的频率和活力与所用PEG的分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。
【实验仪器、材料和试剂】
（一）仪器、用具
刻度离心管、离心机、血细胞计数板、水浴锅、滴管、显微镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、酒精灯等。
（二）材料 鸡红细胞
（三）试剂
1．0.85 % NaCl 溶液
2．GKN液：8.0g NaCl，0.4g KCl，1.77 g Na2HPO4·2H2O，0.69 g NaH2PO4·H2O，2.0g计数继电器葡萄糖，0.01g酚红，溶于1000ml重蒸水中。
3．50%（W/V）PEG仙台病毒溶液
1. 取50g PEG（分子质量=4000）放入100ml 瓶中，高压灭菌20分钟。
2. 让PEG冷却至50～60℃，勿让其凝固。
3. 加入50ml预热至50℃的GKN液，混匀，置37℃备用。
4．Hanks原液 (10×)：
NaCl 80.0g
Na2HPO4·12H2O 1.2ｇ
KCl 4.0g
KH2PO4 0.6ｇ
MgSO4·7 H2O 2.0ｇ
葡萄糖 10.0g
CaCl2 1.4g
1）称取1.4g的CaCl2，融于30～50ml的重蒸水中。
2）取 1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧杯中，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。必须在前一药品完全溶解后，方可加入下一药品，直到葡萄糖完全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水至1000ml。
5．Hanks液：
Hanks原液 100ml
重蒸水 896ml
0.5%酚红 4ml
配好的Hanks液，分装包扎好贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。
6．Janus green 染液
【方法与步骤】
1. 鸡红细胞的获得：
取新鲜鸡血，迅速加入肝素（100U 肝素/ 5ml全血）混合，制成抗凝全血。
2. 鸡红细胞储备液的制备：
在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85 %NaCl溶液，制成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。
3. 鸡红细胞悬液的制备：
取鸡红细胞储备液1ml，加入4ml 0.85 %NaCl溶液，混匀后，1200rpm离心5min，弃去上清液，再加入5ml 0.85 %NaCl溶液按上述条件离心一次。最后，弃去上清液，加入10ml的GKN溶液制成鸡红细胞悬液。
4. 计数：
取0.5ml鸡红细胞悬液，加3.5ml的GKN溶液进行稀释，在血细胞计数板上计数。若细胞浓度过大，用GKN溶液稀释至1107个/ml左右。
5. 鸡红细胞的收集：
吸取1ml鸡红细胞悬液放入离心管中，加入4mlHanks液混匀，1000rpm离心5min。弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。
6. PEG诱导细胞融合：
吸取0.5ml 37℃的50%PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在37℃水浴中静置2min。剥线
7. 终止PEG作用：
缓慢加入5ml Hanks液，轻轻吹打混匀，于37℃水浴中静置5min。
8. 制备细胞悬液：
用吸管轻轻吹打细胞团数次使细胞团分散，1000rpm离心5min，使细胞完全沉降。弃去上清液，加Hanks液，再离心一次，弃多数上清，留少许溶液，混匀。
9. 染和镜检：
吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴，加入Janus green染液混匀，染3min后盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞融合情况。
10. 计算细胞融合率：
细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已融合细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示。
采用方法如下：在高倍镜下随机计数200制备乙酸乙酯的装置个细胞(包括融合的与未融合的细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核)即得出融合率。公式如下：
【注意事项】
1. 本实验中，用0.85%NaCl液代替了Alsver 液。实验证实，用Alsver 液保存的红细胞时间较短，而改用生理盐水则明显延长红细胞的保存时间且不影响细胞融合率。
2. 高Ca2+浓度能够提高细胞融合率。有些抗凝剂中含有和Ca2+结合的化合物，比如Alsver液中柠檬酸钠的酸根与血液中的Ca2+形成难解离的可溶性络合物，导致血液中的Ca2+ 浓度降低，故起抗凝血作用，同时会造成细胞的融合率较低。
3. 必须严格控制PEG的作用时间，通常处理细胞1～2min。PEG和二甲基亚砜（DMSO）并用，可以提高细胞的融合率。
4. 融合细胞继续培养就变成一个细胞，它的染体数不是两核的倍数，因为一些染体会逐渐消失。
【作 业】
1. 画出观察到的融合细胞，并计算融合率。
2. 试说明细胞融合的关键。
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