摘要：自1958年Okada首次表明紫外灭活的仙台病毒可以诱导体外培养细胞融合形成多核体以来，细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术，已在医药、环保、免疫学、医药、食品以及农业等领域的基础研究和应用开发。本文综述了细胞融合技术中的常用方法：仙台病毒（HVJ）诱导法、聚乙二醇（PEG）化学诱导法、电融合诱导法及激光诱导法的基本原理和研究进展。
关键词：细胞；细胞融合；细胞工程
1 引言
在细胞融合是 20 世纪发展起来的一种细胞工程技术，可以在一定的条件的诱导下使两个或多个细胞(原生质体) 相互接触，进而发生膜融合、胞质融合和核融合，从而形成细胞。细胞融合所形成的新细胞( 杂合细胞) 得到了来自两个父本细胞的遗传物质，因而具有新的遗传学或生物学特性[1]。细胞融合逐渐成为细胞工程的一项核心技术，它不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等领域的研究提供了有力手段，
而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、免疫学、医药、食品以及农业等领域具有广泛应用价值[2]。它已成为杂交育种、单克隆抗体制备、动物克隆以及抗癌疫苗研发等现代生物医学研究中的一项关键技术。
随着研究的不断深入，细胞融合技术的应用领域越来越广，产生的影响也日益显著 ， 本文就其现有的研究情况进行讨论。
2 细胞融合技术
2.1仙台病毒(HVJ)诱导法
2.1.1仙台病毒诱导法原理
1962年日本的冈田善雄偶然发现了由仙台病毒引起的细胞融合成多核细胞的现象[2]。由于仙台病毒诱导细胞融合法较简便,特别是许多种类的细胞对其敏感,所以常选用仙台病毒作为细胞融合的诱导剂。仙台病毒属于RNA病毒,其质膜表面存在两种糖蛋白,一种是HANA蛋白,它具有凝集红细胞能力和神经氨酸普酶活性。一种是F蛋白,它具有质膜融合能力(质膜和
细胞膜融合的能力)、细胞融合能力和溶血能力。仙台病毒诱导细胞融合的能力与共质膜表而两种糖蛋白有关:(1)HANA蛋白能使病毒吸附在细胞膜表面,具有凝集素的作用。另外,HANA蛋白的神经氨酸酶活性,可水解细胞膜表面糖蛋白,这也有利于两细胞膜脂质相互作用。(2)F蛋白由F1和F2两个亚单位组成，两个亚单位以二硫键相连,当F蛋白在前体蛋白(F0)的蛋白酶作用下,所产生的F;和F:两个亚单位片断与病毒感染和细胞融合有关[3]。
2.1.2 仙台病毒诱导法操作
细胞融合现象的发现引起细胞学界的高度重视，1965年英国的Harris和Watkins在利用灭活病毒诱导细胞融合方面做了大量的工作，并进一步利用这种灭活病毒来诱导不同种动物细胞间的融合[2]。他们的研究工作证明了在病毒法诱导细胞融合中, 其有效促融因子在于细胞的膜, 病毒膜片(甚至在病毒灭活或被超声打碎后)能使细胞间产生凝聚和融合,因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。
2.1.3研究进展
Kinoh H[4]等研究发现，通过改变其自身融合蛋白Ｆ可增加融合后细胞活性。此外，融合蛋
白还可引起融合的树突状细胞释放白细胞介素-6 （IL-6）而发挥抗肿瘤效应及改变宿主细胞的基因而避免肿瘤转移[5-6]。Saga K[7]硅胶海绵条等发现，调整Sev的ＨＮ表达后对细胞融合及转染等毒性明显降低。目前，该方法被广泛应用于研究转染各种分子包括质粒DNA、SiRNA、蛋白、反义寡核苷酸[7]。
该方法的问题主要在于病毒制备困难，操作复杂， 灭活病毒的效价差异大，实验的重复性差，融合率很低等。这种方法适用于动物细胞融合，主要用于实验室研究。
2.2聚乙二醇（PEG）化学诱导法
2.2.1 聚乙二醇（PEG）化学诱导法原理
实验证明PEG不仅促进细胞凝集,更重要的是它可以引起细胞膜蛋白质和脂质及融合系统中水溶液性质的变化，大量实验证实后者在PEG诱导细胞融合作用中具有重要意义。PEG具有高度亲水性，Tilcock等报道，PEG浓度为38% 时，由于PEG与水之间的氢键形成，溶液中自由水消失，增加PEG浓度可减少结合在磷脂上的水分子，导致细胞脱水而发生膜结构的变化，以促进膜融合[3]。亲水性介质周围分子极性的变化，也影响细胞膜蛋白质结构，
有利于两细胞膜脂质间相互作用及融合发生[3]。
2.2.2聚乙二醇（PEG）化学诱导法方法
艾叶油胶丸PEG分子量为1000-2000时细胞融合率较高。44%的PEG诱导细胞融合率明显高于38%或50%的PEG，作用时间一般控制在2-3min，以逐渐稀释融合系统中PEG的浓度，达到终止PEG作用的目的。 pH和温度是PEG诱导细胞融合的两大影响因素，偏碱环境更利于细胞融合。pH 8.0-8.2时，细胞融合率最高。一定范围内，温度升高也有利于PEG诱导细胞融合，因而PEG诱导细胞融合的操作过程,一般均在37OC水浴中进行[3]。
PEG法的优点是没有种间、属间、科间的特异性或专一性，所以这种方法一直沿用至今。PEG法以其低廉的实验成本和相对较高的融合率，大量应用于各种实验中[8]。虽然 PEG作为融合剂有很多成功的报道，但仍存在着对细胞损伤大、残存毒性、融合率较低及经验性大等缺陷。此后， 一种物理融合技术--细胞电融合技术迅速崛起并显示出强大的生命力。
2.3电融合诱导法
2.3.1电融合诱导法原理
自1978 年Zimmermann等及1979年Senda等报道电脉冲诱导细胞融合成功以来Zimmermann及其同事们做了大量的工作,创立了物理的、实用的 Zimmermann 电融合法。其原理是在短时间强电场的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿。瞬时失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟后恢复原状，当可逆电击穿发生在，个相邻细胞的接触区时，即可诱导它们的膜相互融合，从而导致细胞融合。利用电融合的方法，人们对膜的融合过程和机制进行了进一步的探索。电融合诱导法在农业和医学上也展现了广泛的应用前景。
2.3.2电融合诱导法方法
电融合需在低导电性溶液中进行，一般选甘露醇、蔗糖、葡萄糖等非电解质作电融合液，可以避免当交流电流增大时，过度发热影响细胞串的形成和融合细胞的存活。细胞融合发生的必要条件是成融状态的两个细胞相互接触，接触则可通过特殊的融合槽、过滤、离心和贴壁[9]。
电融合芯片的研制：由于在微芯片中可以将微电极间距做得很小，用很小的电压就可以在电极间产生很高的电场强度，从而诱导细胞融合。集成了微电极的融合芯片系统能够方便地操控细胞，避免高电压对融合细胞存活率的影响及降低细胞电融合对融合信号仪器的高
要求。
零时刻该方法的主要优点是融合效率较高，约是PEG法诱导细胞融合的100倍。另外，还有操作简便、快速、对细胞无毒、可在镜下全程观察及记录细胞的融合过程。目前已被广泛应用，成为细胞融合的主要技术手段，如用于细胞生物结构、植物育种、肿瘤疫苗制备、核移植等研究[10]。
2.4激光诱导法芯片散热片
激光融合法是１９８４年德国学者Schierenberg E使用并报道的一项细胞融合方法。其原理是利用激光微束相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏将２个不同特性、不同大小的细胞在监视（显微镜或荧屏）下实现融合。
研究者们发现[11]，其最大的优势就是可以通过一个远程的控制台控制融合细胞的种类。但其缺点有：1）较电融合技术要求更高的精密仪器；2）融合效率较低；3）技术要求高。这些缺点在很大程度上限制了其在细胞融合领域的应用[10]。目前，激光诱导细胞技术正在日趋完善，在快速发展中。
3 结束语
由于细胞融合在生物、医药领域的巨大潜在应用价值，来自物理、电子、生物、医学等领域的各国科学家相继在该领域倾注了大量人力、物力、财力进行专项研究。动物细胞融合、植物细胞融合、微生物细胞融合以及三者之间的细胞融合不断应用于基础理论研究和人类生产实际。如创造新物种、培育动物新品种、植物育种、种子保存、无性系的快速繁殖、获得优良的微生物菌种以及药物单克隆抗体和肿瘤疫苗等有用物质的生产[10]。同时，病毒所致细胞融合的研究也为肿瘤、疾病（如HIV）的发生、发展及提供新的视野[2]。然而困扰细胞融合的问题如：如何提高融合细胞的效率及纯度、药物单克隆抗体及肿瘤疫苗的质量控制及安全性、新品种的遗传稳定性等仍待进一步研究。
目前，细胞融合技术正面临新的机遇[11]仙台病毒：作为细胞工程核心技术的细胞融合技术与新兴的微流控技术的交汇，有望为细胞融合技术带来一次新的革命，细胞融合芯片技术正在不断发展完善。
参考文献
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