一种养殖海水中活性致病性弧菌总数的现场快检方法与流程

1.本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种养殖海水中活性致病性弧菌总数的现场快检方法。

背景技术：

2.弧菌属细菌形状短小，约0.5μm
×
(1～5)μm，分布广泛，海洋环境中及水生生物体内尤为常见，目前已经定名的有近40种。活性致病性弧菌不但能够导致人类的食源性疾病，也是水产养殖健康安全的威胁之一，比如，对虾早期死亡综合症的根本原因就是遭受弧菌感染。因此，及时、快速测定诸如养殖车间等水体中的活性致病性弧菌对保障安全生产具有重要意义。
3.目前能够检测鱼、虾、蟹、参等海水养殖水体中活性致病性弧菌总数的主要方法是选择性培养基(tcbs肉汤或者tcbs琼脂)培养法，该方法不但需要专业实验室，而且操作繁琐，对人员专业能力要求高；该法用于样品采集、样品转移、实验室培养、结果读取等环节的全部耗时不低于24h，效率较低，无法给生产提供急需的预警作用。还有一些方法，比如基因分析法，包括聚合酶链式反应、等温基因扩增、核酸测序等，虽然有效提高了灵敏度和特异性，但是依然需要专业实验室，在提高效率方面进步有限，而且存在成本较高、活/死细胞区分度较低的问题。此外，其它诸如流式细胞仪法、atp荧光法等，也存在诸如成本高和/或定量准确度底的问题，实用性较差。
4.因此，缺乏能够在现场快速准确测定水体中活性致病性弧菌总数的方法是目前水产养殖业界亟需解决的核心问题之一。

技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明公开了一种养殖海水中活性致病性弧菌总数的现场快检方法，养殖海水样品直接加入到专用选择性液体培养基中，其中活性致病性弧菌在该培养基中的生长速率曲线由电子微生物生长传感器获取，由于该生长速率曲线上最大生长速率对应的培养时间(即时间峰值)c
t
与海水样品中活性致病性弧菌量呈现良好的线性关系，从而将测定的c
t
值代入线性方程，即可计算得到海水样品中活性致病性弧菌的数量。
6.为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
7.一种养殖海水中活性致病性弧菌总数的现场快检方法，包括如下步骤：
8.步骤s1，测定活性致病性弧菌生长速率曲线，得到最大生长速率对应的培养时间c
t
；
9.步骤s2，将c
t
代入线性方程，计算养殖海水样品中活性致病性弧菌总数n。
10.可选地，步骤s1中，所述测定生长速率曲线的步骤，包括：
11.步骤s11，采集养殖海水样品，注入装有专用选择性液体培养基的检测管中；
12.步骤s12，将所述检测管插入电子微生物生长传感器中，测定活性致病性弧菌在专用选择性液体培养基中的生长速率曲线。
13.可选地，所述专用选择性液体培养基，各组分及质量分数如下：
14.酵母浸粉6.0％，蛋白胨9.0％，蔗糖11.6％，枸橼酸钠9.0％，牛胆粉4.0％，牛胆酸钠3.2％，硫代硫酸钠9.2％，氯化钠18.0％，氯化镁1.6％，氯化钙0.6％，硫酸钾0.8％，柠檬酸铁1.1％，其余为水。
15.可选地，所述专用选择性液体培养基装入无菌检测管之前，于121℃灭菌30min。
16.可选地，步骤s11中，采集养殖海水样品采用一次性无菌器具，所述无菌器具包括无细菌污染的注射器或移液器。
17.可选地，步骤s11中，所述养殖海水盐度为16％～35％。
18.可选地，步骤s2中，所述线性方程为logn＝-0.0082c
t
+6.5402，r2＝0.9736。
19.本发明的有益效果是，
20.(1)本发明操作简便，无需具有微生物专业背景的技术人员，用户经过简单培训即可实施检测，因此便于推广。
21.(2)本发明可以在现场实施、效率高，一般养殖车间或者养殖池塘水体中的活性致病性弧菌总数的测定周期不大于7.5h，因此可以为生产安全提供较为及时的预警信息。
附图说明
22.图1为采用电子微生物生长传感器测定的活性致病性弧菌在专用选择性培养基中的生长速率曲线图。
具体实施方式
23.为使本领域具有普通知识的人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及申请专利范围中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，皆具有本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。
24.在本文中，用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其他任何类似用语均属于开放性连接词(open-ended transitional phrase)，其意欲涵盖非排他性的包括物。举例而言，含有复数要素的一组合物或制品并不仅限于本文所列出的这些要素而已，而是还可包括未明确列出但却是该组合物或制品通常固有的其他要素。除此之外，除非有相反的明确说明，否则用语“或”是指涵盖性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一种情况均满足条件“a或b”：a为真(或存在)且b为伪(或不存在)、a为伪(或不存在)且b为真(或存在)、a和b均为真(或存在)。此外，在本文中，用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”的解读应视为已具体公开并同时涵盖“由
…
所组成”及“实质上由
…
所组成”等封闭式或半封闭式连接词。
25.在本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征或条件仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值，特别是整数数值。举例而言，“1至8”的范围描述应视为已经具体公开如1至7、2至8、2至6、3至6、4至8、3至8等等所有次级范围，特别是由所有整数数值所界定的次级范围，且应视为已经具体公开范围内如1、2、3、4、5、6、7、8等个别数值。除非另有指明，否则前述解释方法适用于本发明全文的所有内容，不论范围广泛与否。
26.若数量或其他数值或参数是以范围、较佳范围或一系列上限与下限表示，则其应
理解成是本文已特定公开了由任一对该范围的上限或较佳值与该范围的下限或较佳值构成的所有范围，不论这些范围是否有分别公开。此外，本文中若提到数值的范围时，除非另有说明，否则该范围应包括其端点以及范围内的所有整数与分数。
27.在本文中，在可实现发明目的的前提下，数值应理解成具有该数值有效位数的精确度。举例来说，数字40.0则应理解成涵盖从39.50至40.49的范围。
28.在本文中，对于使用马库什组(markush group)或选项式用语以描述本发明特征或实例的情形，本领域技术人员应了解马库什组或选项列表内所有要素的次级组或任何个别要素亦可用于描述本发明。举例而言，若x描述成“选自于由x1、x2及x3所组成的组”，亦表示已经完全描述出x为x1的主张与x为x1及/或x2的主张。再者，对于使用马库什组或选项式用语以描述本发明的特征或实例的情况，本领域技术人员应了解马库什组或选项列表内所有要素的次级组或个别要素的任何组合亦可用于描述本发明。据此，举例而言，若x描述成“选自于由x1、x2及x3所组成的组”，且y描述成“选自于由y1、y2及y3所组成的组”，则表示已经完全描述出x为x1或x2或x3而y为y1或y2或y3的主张。
29.以下具体实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明及其用途。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下具体实施方式或实施例中所描述的任何理论的限制。
30.实施例1现场测定南美白对虾养殖池水中活性致病性弧菌总数
31.步骤s1，采用1ml一次性无菌注射器(济南秦鲁药业科技有限公司产品)从黄海水产有限公司10号车间南美白对虾养殖池中取水样0.5ml；
32.步骤s2，将水样注入预装载有1.5ml已灭菌专用选择性液体培养基的检测管a中，检测管为一次性圆底聚苯乙烯管(青岛谷峰实验仪器有限公司产品)，外径5mm，内径4.2mm，管长20cm；然后采用0.22mμ的无菌针式滤器(直径13mm，默克密理博公司产品)塞住管口，作为待测样；
33.步骤s3，向另外一只预装载有1.5ml已灭菌专用选择性液体培养基的检测管b中加入0.5ml无菌水，同样采用0.22mμ的无菌针式滤器塞住管口，作为对照样；
34.步骤s4，将装有待测样的检测管a和装有对照样的检测管b同时、分别插入er832型便携式电子微生物生长传感器(澳大利亚edaq公司产品)的两个通道中，自动化测定两管中细菌的生长速率曲线，参数设定为：激励电压20v，激励频率160khz，信号记录周期1min，信号记录次数600；所述电子微生物生长传感器为基于电容耦合非接触电导检测原理的per-16型或者per-32型，该传感器自带蓄电池电源；
35.步骤s5，测定结束后，对应检测管a得到生长速率曲线，如图1所示，c
t
为348min；对应检测管b没有出现弧形曲线，表明培养体系未被污染。
36.步骤s6，将c
t
值代入logn＝-0.0082c
t
+6.5402(r2＝0.9736)，得到活性致病性弧菌总数n为4860cfu，即所采集的0.5ml养殖海水样品中含有活性致病性弧菌的数量为4860cfu。
37.步骤s1～s6共耗时约6h。
38.步骤s2和s3中，所述专用选择性液体培养基，各组分及质量分数如下：酵母浸粉6.0％，蛋白胨9.0％，蔗糖11.6％，枸橼酸钠9.0％，牛胆粉4.0％，牛胆酸钠3.2％，硫代硫酸钠9.2％，氯化钠18.0％，氯化镁1.6％，氯化钙0.6％，硫酸钾0.8％，柠檬酸铁1.1％，其余为
水。将除水以外的组分按照上述质量分数放入水中，混合，搅拌均匀。
39.采用经典培养-计数法测定养殖海水样品中活性致病性弧菌总数，步骤如下：
40.步骤s1，从养殖池中随机取100ml水样放入无菌微生物样品瓶中，将水样置于保温箱中运送到专业生物检测实验室，其中保温箱内温度4～8℃；
41.步骤s2，采用5ml移液器(大龙科技有限公司产品)无菌操作取待测养殖海水样品2ml，放入50ml无菌离心管，加入18ml生理盐水，振摇试管使其混合均匀，制成1:10的样品匀液；
42.步骤s3，按s2操作，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用1次5ml无菌吸头；
43.步骤s4，选择3个适宜稀释度的样品匀液，移液器吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做三个平皿，同时，分别吸取1ml空白生理盐水加入三个无菌平皿内作空白对照；
44.步骤s5，将20ml冷却至46℃的tcbs琼脂培养基(青岛海博生物技术有限公司产品)倾注平皿，并转动平皿使其与样品匀液混合均匀；
45.步骤s6，待琼脂凝固后，将平板翻转，36
±
1℃培养24h；
46.步骤s7，培养结束后，肉眼观察并记录tcbs琼脂培养基平板上的菌落数量；
47.步骤s8，选取菌落数在30cfu～300cfu之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数(每个稀释度的菌落数采用三个平板的平均数)；结果发现稀释100倍的三个平板上的菌斑分别为60cfu、102cfu和112cfu，计算得知所采集的养殖海水样品中1ml体积内含有活性致病性弧菌的数量为9100cfu，即0.5ml体积内含有活性致病性弧菌的数量为4550cfu。
48.步骤s1～s8共耗时约26h。
49.本发明与经典方法数据间的对比分析：
50.1)采用本发明技术测定0.5ml体积养殖海水内含有活性致病性弧菌的数量为4860cfu，采用经典方法测定的数据为4550cfu，相对偏差为6.8％，说明本发明检测结果具有很好的可靠性。
51.2)采用本发明方法测定养殖海水内活性致病性弧菌总数耗时约6h，比经典方法节约了20h，表明本发明的方法具有更高的效率。
52.3)诸如取样、加样、上机等本发明所有操作，用户只需经过简单的培训即可掌握，而经典的培养-计数方法中所涉及平板涂覆、倾注等动作的成功与否严重依赖操作者的熟练程度，即本发明方法更易于推广。

技术特征：

1.一种养殖海水中活性致病性弧菌总数的现场快检方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤s1，测定活性致病性弧菌生长速率曲线，得到最大生长速率对应的培养时间c
t
；步骤s2，将c
t
代入线性方程，计算养殖海水样品中活性致病性弧菌总数n。2.如权利要求1所述的一种养殖海水中活性致病性弧菌总数的现场快检方法，其特征在于，步骤s1中，测定活性致病性弧菌生长速率曲线，包括：步骤s11，采集养殖海水样品，注入装有专用选择性液体培养基的检测管中；步骤s12，将所述检测管插入电子微生物生长传感器中，测定活性致病性弧菌生长速率曲线。3.如权利要求2所述的一种养殖海水中活性致病性弧菌总数的现场快检方法，其特征在于，所述专用选择性液体培养基，各组分及质量分数如下：酵母浸粉6.0％，蛋白胨9.0％，蔗糖11.6％，枸橼酸钠9.0％，牛胆粉4.0％，牛胆酸钠3.2％，硫代硫酸钠9.2％，氯化钠18.0％，氯化镁1.6％，氯化钙0.6％，硫酸钾0.8％，柠檬酸铁1.1％，其余为水。4.如权利要求2所述的一种养殖海水中活性致病性弧菌总数的现场快检方法，其特征在于，步骤s11中，采集养殖海水样品采用无菌器具，所述无菌器具包括无细菌污染的注射器或移液器。5.如权利要求2所述的一种养殖海水中活性致病性弧菌总数的现场快检方法，其特征在于，步骤s11中，所述养殖海水的盐度为16％～35％。6.如权利要求1所述的一种养殖海水中活性致病性弧菌总数的现场快检方法，其特征在于，步骤s2中，所述线性方程为logn＝-0.0082c
t
+6.5402，r2＝0.9736。

技术总结

本发明公开了一种养殖海水中活性致病性弧菌总数的现场快检方法，涉及微生物检测技术领域，包括如下步骤：步骤S1，采用电子微生物生长传感器测定活性致病性弧菌在专用选择性液体培养基中的生长速率曲线，得到最大生长速率对应的培养时间C

技术研发人员：

曲克明 杨倩倩 张艳 张旭志 赵俊 徐勇 闫华 马良钰

受保护的技术使用者：

中国水产科学研究院黄海水产研究所

技术研发日：

2022.09.27

技术公布日：

2022/12/12