1、水：HPLC级；乙腈：HPLC级；乙醇：HPLC级；
2、200mM NH4HCO3溶液：取NH4HCO3 加水溶解并稀释到50ml。稀释4倍得到50 mM NH4HCO3溶液，稀释8倍得到25 mM NH4HCO3溶液；
3、25mM NH4HCO3的50%的乙醇-水溶液（考染脱液）： 50%乙醇-水溶液和50mM NH4HCO3溶液等比例混匀；
4、10%乙酸的50%乙醇-水溶液；
5、DTT溶液：10mM DTT的25mM NH4HCO3溶液（ml，现配此浓度，-20℃保存须两天内用完）；
6、IAA溶液： 55mM IAA的25mM NH4HCO3溶液（ mg/ml，现配此浓度，避光保存，-20℃保存须两天内用完）；
7、Trypsin 溶液：取储存于-80℃的分装浓缩酶溶液（浓度为100ng/ul（20ug到200ul），溶于50 mM NH4HCO3溶液中）,用50 mM NH4HCO3溶液稀释为10ng/ul，全程冰上操作；
8、50％乙腈-水溶液（含5%三氟乙酸）；
9、75%乙腈-水溶液（含%三氟乙酸）；
10、%三氟乙酸-水溶液；
11、50%乙腈-水溶液（含%三氟乙酸）。
12、避光新鲜配置脱液(银染)：50 mM NaS2O3: 15 mM K3Fe(CN) = 1：1混合
取胶
1. 用超纯水清洗胶块2次，用手术刀片切下胶上目标条带，用手术刀片充分切碎(1mm3大小，用HPLC级异丙醇和水分别洗涤手术刀和镊子)。 第一天：
考马斯亮蓝染凝胶的脱
2. 把切碎的胶块置于管中（预先加入1ml考染脱液，含25mM NH4HCO3的50%的乙醇-水溶液），室温震荡15-20min（在混匀仪中高速震荡混匀），重复2-3次，直至胶块无，14000rpm离心1min, 去上清。 3. 加入1ml 10%乙酸的50%乙醇-水溶液在恒温混匀仪上室温震荡洗涤胶块2次，每次30分钟，去上清。
4. 加入1ml水，在恒温混匀仪上室温轻微震荡洗涤胶块胶块2次，每次5-10分钟，去上清。
5. 加乙腈1ml漩涡混合洗5min，弃液，真空抽干10min（1308室Christ冻干仪，使用浓缩功能，下同）。
Destain银染凝胶的脱
1.加 500μl脱液，室温避光震荡5～10 min，14000rpm离心1min，弃去溶液，重复 1～2 次至胶块去除银染颜。
2.加 500 μl 50mM NH4HCO3，震荡 5～10min，14000rpm离心1min，弃去溶液，重复 1～2次至溶液无明显黄。再加 500 μl 50%乙腈，震荡 5～10 min，14000rpm离心1min，弃去溶液。
3.加 500μl 50mM NH4HCO3，震荡 5～10min，14000rpm离心1min，弃去溶液。再加1ml 50%乙腈，震荡 5～10 min，14000rpm离心1min，弃去溶液，至胶块呈白。
5. 加乙腈1ml漩涡混合洗5min，弃液，真空抽干10min（1308室Christ冻干仪，使用浓缩功能，下同）。
还原烷基化
5. 加入 30-60ul (可适当多加，没过胶条) DTT溶液，56℃不倒翁牙刷
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恒温混匀仪上震荡孵化1小时，冷却至室温，离心去上清，真空抽干10min。 6. 加入 30-60ul IAA溶液(体积与DTT大体相同)，暗处室温孵育45min，去上清。
7. 加1ml 50 mM NH4HCO3溶液震荡洗胶块10min，14000rpm离心1min,去上清。
8. 加1ml水震荡洗胶块10min，14000rpm离心1min,去上清。
9. 加乙腈1ml漩涡混合洗5min，14000rpm离心1min, 去上清，真空抽干10min。
酶解
10. 把胶粒转移至的离心管中，加入25～35ul Trypsin 溶液（酶与底物蛋白的质量比约为1:20～1:50），冰上放置10min，中间检查确保胶块完全浸泡在酶液中，如果没有充分吸胀，补加一定量的酶液（酶液体积根据胶块大小确定，稍多于胶水溶液状态体积）待溶液被胶块完全吸收，加10～20ul 50mM NH防水袋4HCO3， 37℃酶解16-20小时。
第二天：
肽段提取
10.吸出酶解液至新的离心管中，加2-3倍于胶体积的50％乙腈-水溶液（含5%三氟乙酸）至原管中（视胶条大小而定），恒温混匀仪室温震荡15min（不可漩涡离心混合），离心1min，吸取上清转移至同一离心管中，盖管标记。
生活垃圾处理器11.加2-3倍于胶体积的75%乙腈-水溶液（含%三氟乙酸）中，恒温混匀仪室温震荡10min（不可漩涡离心混合），离心1min，吸取上清合并至上管中。
12. 加2-3倍于胶体积的乙腈中，恒温混匀仪室温震荡5min（不可漩涡离心混合），离心1min，吸取上清合并至上管中。
13.合并3次提取液，真空干燥，-20℃保存。保存胶条，备用（防止酶解不充分）。
14.样品制备完成，溶解样品在10ul %三氟乙酸-水中。
微量蛋白及肽段溶液的 Ziptip脱盐
1. 准备：
(1)、平衡管1：乙腈（1ml/支，离心管）；
(2)、平衡管2：50%乙腈-水（含%三氟乙酸）（1ml/支，离心管）；
(3)、平衡管3： %三氟乙酸-水（1ml/支，离心管）；
(4)、脱盐管：%三氟乙酸-水（1ml/支，离心管）；
(5)、洗脱液管： 50%乙腈-水（含%三氟乙酸）（10ul/支，离心管，如样品含疏水性肽段较多，可以增加乙腈至75%）
2. 具体操作如下：
（1）平衡：乙腈冲洗 ziptip 1次（吸取-废弃至管外低尘纸上），50%乙腈-水冲洗 ziptip 1次（吸取-废弃至管外低尘纸上），%三氟乙酸-H2O冲洗 ziptip 5次（吸取-废弃至管外低尘纸上）；
（2）吸附样品：加10uL %三氟乙酸-水充分溶解，低速离心，ziptip反复吸打样品 15-20次；
（3）冲洗：%三氟乙酸-水冲洗 ziptip 3次（吸取-废弃至管外低尘纸上）；
（4）洗脱：用 10uL 洗脱液反复吸打 ziptip 15-20次。
(5) 复溶：真空抽干，在洗脱液管中加入 %甲酸-水6ul，在旋涡混合仪上充分溶解，待质谱
分析。
蛋白质前处理注意事项
注：上述过程需要：
1、 洁净的环境，实验服、口罩、帽子、无粉或乙烯基手套（严禁使用乳胶手套）操作，实验过程中一定要注意使用的溶液和器具的洁净，防止角蛋白污染，并带口罩和帽子；尽量避免蛋白质点和相关溶液与外界空气接触, 避免可能造成的污染。
2、 对于鉴定修饰样品，蛋白纯度和丰度越高越好，需要尽可能的提高蛋白纯度和丰度。
3、 胶条保存在离心管中，加入相当于胶条高度1/3的水，在胶条处理之前保持湿润状态，防止胶条变干，胶条保存放在4℃。
4、 网络滤波器所有离心管、头均为进口产品；所有试剂均为进口分析纯，实验用水均为进口HPLC级；
自动感应垃圾桶5、 每加一次溶液都要漩涡振荡，胶粒要完全浸没在溶液中，进行下一步操作前要把溶液
吸走。
6、 加酶之前，可不用换移液头；但在加酶之后，必须每管换头，因为酶将蛋白释放出来；
7、 Ziptip u-C18多肽吸附量 1-2ug(鉴定修饰), Ziptip C18多肽吸附量 1-5ug（其他）。
8、 尽可能在最短的时间内完成脱盐前的步骤，不建议中间步骤停顿过夜，含盐蛋白干粉相对稳定，脱完盐后须尽快进行质谱分析。
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