大肠菌检测过程中可能遇到的常见问题及解答
大肠菌检测过程中可能遇到的常见问题及解答
一、常用检测标准
GB/T 4789.3-2003 食品卫生微生物学检验大肠菌测定 GB 4789.3-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌计数
GB 4789.28-2013 食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求 GB 4789.1-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验总则pe导电母粒
GB 4789.41-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆科检验
GB/T 27405-2008 实验室质量控制规范食品微生物检测
GB/T 16294-2010 医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法
二、常见问题及解答
（一）检测方法选择
Q1：食品中大肠菌的检测有两个标准三种方法，该如何选择呢？
A：依据产品标准的项目单位
1、若单位为CFU/g，则选择GB 4789.3-2016第二法（平板计数法）。如：GB 19300-2014 食品安全国家标准坚果与籽类食品；
2、若单位为MPN/g，则选择GB 4789.3-2016第一法（MPN计数法）。如：NY/T 1885-2017 绿食品米酒；
3、若单位为MPN/100g，则选择GB/T 4789.3-2003。如：Q/KSJ0001S-2018 果蔬脆片。
Q2：MPN法3个适宜的连续稀释度该怎样选择？
A：依据产品标准的项目标准值
1、若标准值为＜3.0MPN/g，则选择0.1g、0.01g、0.001g三个稀释度。如：NY/T 1885-2017 绿食品米酒；
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2、若标准值为≤30MPN/100g，则选择1g、0.1g、0.01g三个稀释度。如：Q/KSJ0001S-2018 果蔬脆片。1g由接种10mL 0.1g/m L至双料乳糖胆盐发酵管得来。
Q3：怎样采样，才能使样品具有代表性？
A：这里将样品分为两类：预包装食品和散装食品或现场制作食品。
1、对于预包装食品
美甲片A、应采集相同批次、独立包装、适量件数的食品样品，每件样品的采样量应满足微生物项目检验的要求。
B、独立包装≤1000g 的固态食品或≤1000mL 的液态食品，取相同批次的包装。
C、独立包装＞1000mL 的液态食品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均质后采集适量样品，放入同一个无菌采样容器内作为一件食品样品；＞1000g 的固态食品，应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品，放入同一个无菌采样容器内作
为一件食品样品。
2、对于散装食品或现场制作食品
用无菌采样工具从n 个不同部位现场采集样品，放入n 个无菌采样容器内作为n 件食品样品。每件样品的采样量应满足微生物项目检验单位的要求。
（三）物资准备
Q4：结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）使用前不需要高压灭菌，是否会存在污染的可能？A：大肠菌是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌存在也会被杀灭，所以不会从培养基带入污染。当然盛装培养基的容器需要进行高压灭菌，以免容器引入污染。此外，VRBA是一种选择性培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵验证，因此VRBA培养基就无需高压灭菌。但需要注意的是，VRBA需要现配现用，完成配制的培养基应当在3h之内使用完毕。 Q5：MPN管灭菌后为什么小导管内会有气泡以及该如何解决？
A：原因一：过早打开灭菌锅
当灭菌锅压力表降为0而温度表示数还高于室温时，不要打开灭菌锅。因为打开锅盖瞬间，锅内大量热量散出，温度突然降低，试管内温度也随着降低，导致管内气压减小，沸点降低，部分水会汽化留在小导管内。 解决措施：待灭菌锅内气压和温度都降到与室温一致或相差不大时再打开灭菌锅。
原因二：试管塞塞得太紧（使用硅胶塞的时候）
试管塞塞得太紧在灭菌时会导致试管内与灭菌锅内压力不一致。在灭菌锅升温升压时，锅内压力会大于管内压力。锅内压力会大于管内压力时，试管内压力不够，不能将小导管内气体排尽，就留有气泡；试管塞塞得太紧同样会导致灭菌锅降温降压时，锅内压力小于管内
压力。锅内压力小于管内压力时，可能会使试管塞和培养基崩出，培养基报废。
解决措施：改用透气性好的棉花塞，切勿使用橡皮塞。
原因三：小导管口径太小
我们把一根毛细管一端封口，另一端插进水里，毛细管里怎么都不会进水。同样把一个烧杯倒扣进水里就很容易进水了。小导管在加压后一方面水要进去，另外里面的空气要出来，如果口太小的话，空气不容易出去，水也不容易进来，就会导致气泡留在里面。
解决措施：改用内径较大的导管，尽量使用V型管，不要使用锥型管。
原因四：培养基质量问题
izo由培养基质量引起的气体不能排尽或培养基含有高温高压分解产气的成分。灭菌时用水做培养基组的对照试验，若培养基组有气泡，而对照组没有气泡，可确定是有此原因引起。
解决措施：改用其它品牌的培养基，且培养基使用前要通过技术验收。
原因五：灭菌锅工作压力不够，使气体不能排尽
灭菌锅最大压力不够不能使管内液体强行把气体挤出，最后会留有小气泡。灭菌锅工作压力不够还会使温度上升缓慢，或达不到灭菌温度。此原因的可能性较小，我们可以在排除
原因一、二、三、四的情况下，用不加试管塞、大口导管做试验，若还仍不能达到效果，就需要检查灭菌锅了。
解决措施：检修灭菌锅，且定期用压力蒸汽灭菌生物指示剂监测灭菌效果。
Q6：培养基的不正确配制会出现哪些异常现象以及可能的原因？
A：异常现象一：培养基不凝固
原因分析：
①制备过程中过度加热；
①低pH造成培养基酸解；
①称量不正确；
①琼脂未完全溶解；
①培养基成分未充分混匀。
缘114异常现象二：pH不正确
原因分析：
①制备过程中过度加热；
①水质不佳；
①外部化学物质污染；
①测定pH时温度不正确；
①pH计未正确校准；
①脱水培养基质量差。
异常现象三：颜异常
三相马达原因分析：
①制备过程中过度加热；
①水质不佳；
①pH不正确；
①外来污染；
①脱水培养基质量差。
异常现象四：产生沉淀
原因分析：
①制备过程中过度加热；
①水质不佳；
①脱水培养基质量差；
①pH计未正确控制；
异常现象五：培养基出现抑制/低的生长率
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