纪永生[1,2];郭文豪[1,2]
【摘 要】传统的侧向层析免疫诊断试剂（LFI, lateral flow immunoassay）具有快速、便宜、操作简便等特点.但是检测灵敏度相对于ELISA,免疫荧光,化学发光等检测试剂较低.为提高传统LFI的检测灵敏度,研究者开发了多种方法.本文讨论了常用的几种方法,并且对各自的优缺点进行了阐述.
【期刊名称】《生物技术世界》
【年(卷),期】2016(000)001
【总页数】2页(P102-103)
【关键词】侧向层析;免疫诊断;信号放大物理除垢
3AS4-12
【作 者】纪永生[1,2];郭文豪[1,2]
【作者单位】[1]生物梅里埃（上海）生物制品有限公司,上海201315;[2]上海交通大学,上海200240
【正文语种】中 文
【中图分类】R446.6
侧向层析免疫诊断（Lateral flow immunoassay）是出现于20世纪80 年代初期的一种将免疫技术和谱层析技术相结合的基础上建立的一种简单、快速的免疫学检测技术［1］。它是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在硝酸纤维素膜（NC 膜）上，把标记过的另一抗原或抗体吸附在标记物垫上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解标记物垫上的已经标记过的抗原或抗体后相互反应，再移动至固定了抗原或抗体的区域时，待测物和标记物反应后的复合物与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，通过可目测的显标记物得到直观的结果由于该技术操作简便［2］，快捷，试剂成本低。操作人员不需要接受特别的培训。因此，近30年来，它被广泛应用于医学诊断，工业分析，食品安全以及环境检测等各个方面［3］。但是跟传统的酶联免疫检测试剂，荧光标记免疫检测试剂，放射标记免疫检测试剂等等相比，灵敏度显得相对低，为了拓宽侧 向层析免疫诊断试剂的应用范围，各种放大信号，提高灵敏度的方法也被应用到侧向层析免疫诊断的平台上。本文就一些放大信号的方法做一下讨论。
在侧向层析免疫诊断试剂中最常用的显标记物是纳米胶体金颗粒和纳米彩乳胶微球。采用的纳米胶体金颗粒一般在10nm到60nm，而采用的纳米彩乳胶微球一般在200nm到400nm。胶体金颗粒表面积小，蛋白吸附的少，但是颜深。乳胶颗粒表面积大，蛋白吸附的多，但是颜浅。两者在实际应用中，体现的灵敏度比较接近。为了寻求更高的灵敏度，其他各类标记物也被应用到了侧向层析免疫诊断的平台上。 外置电源
1.1 量子点quantum dots
量子点（q u a n t u m d o t s），又称半导体纳米微晶粒（semiconductor nanocrystal），通常是由ⅡB和ⅥA族元素组成，目前研究较多的主要是CdX（X=S、Se、Te）。通常量子点的研究粒径范围为2～20nm，在受到光激发或电压后能产生荧光发射［4］。量子点也可以标记各种分子到它们的表面，因此它也被应用到了侧向免疫层析免疫诊断试剂中，作为显标记物，取代胶体金颗粒或者乳胶颗粒。但是需要配备紫外灯去激发量子点的荧光，同时要荧光读数仪判读结果，或者用数码相机拍摄显示荧光的照片。如
果需要肉眼判读结果，需要佩戴橙过滤眼睛。相比于胶体金，荧光量子点可以提高灵敏度10到300倍。但是提高灵敏度的同时，也丢失了LFIA一部分简便的特性，它需要额外的仪器去做判读。
1.2 磁珠Magnetic Nanoparticle
磁珠是指有磁性的Fe3O4颗粒。体积可以从nm级到um级。与胶体金颗粒相比，磁珠没有鲜明的颜，呈深褐。除了肉眼可辨外，它也可以通过磁信号检测进行追踪。同时，用磁珠作为标记物制成的检测试剂，信号可以长时间保存，在首次检测以后可以再回顾复测。相比于常规的胶体金检测试剂，用磁信号检测时，灵敏度能提高40倍［5］。缺点是与量子点标记一样，需要额外的仪器帮助判读。
1.3 上转换磷光材料标记UCP
上转换磷光材料（UCP）是一种可以对能量进行尚转换的稀土金属合成物。它在红外光激发下，能够发射波长短于激发光的可见光。用UCP材料作为标记物，可以大幅提高检测的灵敏。同时由于不同的UCP材料具有不同的特征光谱， 可以一次性对生物样品的多种目标
进行检测。而独特的上转换发光现象，使它跟其他的荧光材料相比，消除了待检样品自发荧光的干扰，提高了信噪比。同其他的荧光标记物一样，UCP也需要荧光读数仪来判读。
1.4 酶标记Enzyme
采用ELISA的方法，将标记物垫上的蛋白标记上酶，如HRP ，试剂条的其他结构不变。在第一步加入样品层析完成以后，再加入底物，通过显反应得到不同强度的条带。相较于普通的侧向层析，测试的步骤增加了，需要添加底物，以及清洗。整体的测试时间也会延长。如果催化产生的是荧光，那么同样还需要荧光读数仪进行判读。虽然信号放大了，但是需要耗费的成本也增加了。
蒸压加气块1.5 同时采用金颗粒标记和酶标记
（1）将HRP酶标记到金颗粒上［6］。（2）将HRP酶标记到抗体或抗原上，然后把抗体或抗原再标记到金颗粒上。HRP催化底物（3，30，5，50-Tetramethylbenzidine （TMB）； 3-Amino-9-ethylcarbazole（AEC）； 3，30-Diaminobenzidine tetrahydrochloride （DAB））反应显。同时金颗粒的存在也会加强酶催化底物的显反ktkp-073
应。这个三个底物产生的显物是非可溶性的，因此不会发生层析，从而留在本来已经产生的带的位置，从而加强了信号。同单酶标记一样，操作时需加入，清洗，加底物，清洗等环节，因此操作步骤增加，测试时间延长。
1.6 银染法
由于操作简单，灵敏度高等特点。银离子在纳米金颗粒外部成核的现象已经被广泛应用于定性和定量的生物感应器的信号放大。侧向层析免疫诊断试剂也可以用银染法获得更高的灵敏度。当然，它是建立在金颗粒标记的基础上的。在第一步层析免疫反应已经完毕后，金颗粒已经在测试线聚集。在试剂条测试线的位置加入硝酸银溶液和氢醌溶液或者将试剂条浸入溶液中，使已在抗原位置沉积的金颗粒发挥催化作用，促进银离子被氢醌还原为银原子，后者围绕金颗粒形成一层黑的银壳，而大幅度增强带的深度。放大的效果是在10倍以上［7］。可是作为快速诊断试剂，在侧向层析免疫反应完成以后，额外还要进行银染，同样还是增加了操作步骤。为了达到平常的侧向层析免疫诊断试剂的操作简易程度。
1.7 红外信号检测法
覆膜胶
金属纳米颗粒在光照下产热。通过这个原理，运用普通的LED光源和红外线接收也可以大幅提高普通金标记的侧向层析免疫诊断试剂的灵敏度。提高幅度达32倍，甚至有潜力到1000倍。采用这种方法，无需对传统的金标记侧向层析免疫诊断试剂做改变。无需更换标记物。只需要建立参考值或标准曲线。需要更多考虑的是如何才能产生稳定的热信号，将CV控制的尽量低。
1.8 聚合金颗粒法
聚酰胺-胺型树枝状高分子（PAMAM），像树枝一样，具有很多分叉，水溶性，是具有多功能性的大分子。可以定制精确的大小和形状，以及表面的基团。得益于外围的功能性树枝状基团，很多位点可以用来连接各种分子，以及纳米颗粒，比如量子点。纳米金颗粒通过电荷作用同样也可以连接到PAMAM的表面。单个纳米金颗粒由于体积小，能包被的抗体或抗原比较少，通过PAMAM的作用，可以将多个纳米金颗粒组成纳米金团，增大单个金团的表面积，增加抗体抗原的包被量，从而提高灵敏度。聚合金颗粒法相比传统的单金颗粒侧向层析免疫诊断试剂，依然可以用肉眼判读。主要改变的就是增加了聚合单个纳米金颗粒成为纳米金团的步骤，随后标记抗原抗体，以及制作其他组分的过程都一样，而灵敏度
可以提高20倍。所以在侧向层析免疫诊断试剂开发的过程中有较大的应用潜力。所需要特别注意的是，严格控制PAMAM的量，以及聚集时间，避免过多的纳米金颗粒聚集从而沉淀。
1.9 双层金标垫法
传统金标记侧向层析免疫诊断试剂在样品垫和膜之间有一层标记垫。双层金标垫法就是在传统的试剂结构上再加一层金标垫。这上面包被的金颗粒，用于捕获另一层金标垫的伤的金颗粒。第一层的金颗粒了标记了捕获目标抗原的抗体，同时用BSA进行封闭。所以最后金颗粒连着的是抗体以及BSA。第二层的金颗粒包被抗-BSA抗体，再选用另一个封闭剂封闭（人血白蛋白，PEG等）。在反应过程中，第一层的金颗粒上的抗体抓住抗原，再被另一个包被在膜上的抗体截留在测试线。第二层的金颗粒在层析的过程中，被第一层的金颗粒拦截。从而使更多的纳米金颗粒在测试线位置聚集放大测试信号。双层金标垫方法可以使灵敏度提高40到1000倍［8］。
在银染法中已经提到过，研究者结合银染法，运用双向层析结构，使得银染操作也在一步完成，以便获得高灵敏度的同时，保留操作的简易性。这一节讲的是，传统试剂条结构的
变化对信号放大的作用。研究者通过增加金标垫和样品垫的尺寸，保留测试线原有的宽度，提高了标记物的使用了，而且延长了层析反应的时间，最后获得灵敏的提高，信号放大了约8倍。试剂条整体改动的不大，但是对于生产却增加了不少难度。并且由于增加了样品垫的尺寸，对样品的加入量也有了更大的需求。
2.1 改变操作过程
为了获得高灵敏度，有研究者采取了浓缩样品中目标蛋白的方法，获得更高浓度的目标蛋白复合物的浓度，再加入到试剂条上，进行测试。灵敏度也能提高10倍。浓缩的方法是借用Triton X114能与水在4度混溶，而在37度能形成水相和去污剂相的原理，以及生物分子的疏水性和分子量大小等特性会让它们在水相和去污相形成不同分布浓度的特性实现的［24］。研究也尝试了将金颗粒与样本混合反应后再进行浓缩，同意也是可行的。虽然两者在不同的检测项目上都显现出了10倍的信号放大，但是混合金颗粒和样本，加长了样本与金颗粒的反应时间，所以有着更高放大倍数的可能性。相对于传统操作方法，多了预加样，并且需要不同温度的孵育，对于POC的应用提出较高的条件，但是对于灵敏度的提高，效果还是比较直观的。
2.2 应用Streptavidin-biotin系统
Streptavidin和biotin是一对具有高亲和力的物质，至少比抗原-抗体结合力高百万倍， 是目前发现的自然界中具有最强亲和力的物质［9］。在双层金标垫法中，Streptavidin-biotin被用来作为两个金颗粒之间的连接系统。除了这个应用外，它也被直接应用于传统的侧向层析免疫诊断试剂，用于信号放大。
LFI已经在医学，工业，研究多个领域得到了广泛的应用，通过各种信号放大的方法，LFI检测灵敏度得到进一步提高，应用范围也将更将宽广。在将来，信号放大的方法也将进一步融合，使得信号得到层级放大，最后接近甚至达到各类大型自动化免疫仪器所具有的灵敏水平。
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