一种提取血耳中活性成分的方法

1.本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种提取血耳中活性成分的方法。

背景技术：

2.血耳(tremella sanguinea peng)，又名血银耳、药耳，属异担子菌亚纲银耳目银耳科银耳属。与同属的银耳不同的是，血耳子实体的“花朵”紧实、泽深红、久煮不散，中医古籍记载，血耳具有多种药理作用，是我国特有的高值、珍稀食用菌。目前，研究人员已在湖北省襄阳市保康县实现了血耳的大规模人工种植，解决了野生血耳资源稀少、传统种植规模小的缺陷。然而，当前血耳的主要产品形式以简单的干制品为主，深加工产品种类稀少，导致血耳及其产品的受众面窄，而这与血耳的加工及处理技术的缺失密不可分。
3.研究表明，血耳子实体中含有大量的多糖、多酚等生物活性组分。多糖具有丰富的应用价值，可用作食品加工助剂，也作为膳食补充剂，发挥抗肿瘤、降血脂、抗氧化等药理活性。与银耳不同的是，除多糖外，血耳的蛋白含量较高，更具营养价值；更重要的是，血耳中含有大量的血耳素(红褐)，可作为天然着剂，并具有较高的抗氧化活性，能提高食品营养价值、延长食品保存期。然而，血耳多糖、血耳素等生物活性成分的热稳定性较差，例如，血耳多糖在高温、酸性条件下易水解。而酶处理、热水浸提等传统的多糖方法均需要较高的提取温度(如50-100℃)，这些该类方法还存在能耗高且易破坏血耳中活性成分的缺陷，因此不适宜用于血耳多糖等组分的提取。

技术实现要素：

4.本发明的主要目的是提出一种提取血耳中活性成分的方法，旨在提供一种能够高效提取出血耳中多种活性成分的方法。
5.为实现上述目的，本发明提出一种提取血耳中活性成分的方法，包括以下步骤：
6.将血耳粉末与低共熔溶剂混合，在室温下对所述血耳粉末进行超声萃取，然后离心并收集上清液，得血耳浸提液；
7.向所述血耳浸提液中加入沉淀助剂，经混匀、静置、离心后取沉淀物，将所述沉淀物洗涤、离心后加入至蒸馏水中进行水浴溶解，得溶解液；
8.采用超滤管对所述溶解液进行过滤，分别得到滤过物和截留物；
9.向所述滤过物中加入冷冻的乙醇，离心后取上清液进行旋蒸，得到以血耳粗多酚为主的小分子提取物；
10.将所述截留物加水溶解稀释，得到以血耳粗多糖为主的大分子提取物。
11.可选地，所述低共熔溶剂的氢键受体为氯化胆碱，所述低共熔溶剂的氢键供体为丙二醇、氯化锌、乙二醇、尿素、丙三醇、聚乙二醇、山梨醇、草酸或柠檬酸。
12.可选地，将血耳粉末与低共熔溶剂混合，在室温下对所述血耳粉末进行超声萃取，然后离心并收集上清液，得血耳浸提液的步骤之前，还包括：
13.以尿素为氢键供体，氯化胆碱为氢键受体，加入去离子水，混匀后于75～85℃下孵
育至溶液澄清透明且无晶体析出，得到低共熔溶剂。
14.可选地，以尿素为氢键供体，氯化胆碱为氢键受体，加入去离子水，混匀后于75～85℃下孵育至溶液澄清透明且无晶体析出，得到低共熔溶剂的步骤中：
15.所述氢键受体、氢键供体的摩尔比为1:1～4，所述去离子水的质量为所述氢键受体和氢键供体总质量的15～25％。
16.可选地，将血耳粉末与低共熔溶剂混合，在室温下对所述血耳粉末进行超声萃取，然后离心并收集上清液，得血耳浸提液的步骤中：
17.每0.1～1g的所述血耳粉末对应与10～200ml的所述低共熔溶剂混合；和/或，
18.所述血耳粉末的目数不小于100目；和/或，
19.所述超声萃取的超声波功率为150～650w，超声开启频率为工作30s/停止30s，萃取时间为0.5～2.5h，萃取温度为不高于25℃的室温。
20.可选地，向所述血耳浸提液中加入沉淀助剂，经混匀、静置、离心后取沉淀物，将所述沉淀物洗涤、离心后加入至蒸馏水中进行水浴溶解，得溶解液的步骤中：
21.所述沉淀助剂包括无水乙醇和异戊醇，所述无水乙醇和所述异戊醇的体积比为3～5:1；和/或，
22.所述血耳浸提液与所述沉淀助剂的体积比为1:3～5；和/或，
23.所述水浴溶解的温度不高于37℃，溶解时间为1～3h。
24.可选地，采用超滤管对所述溶解液进行过滤，分别得到滤过物和截留物的步骤，包括：
25.将所述溶解液置于超滤管中，于10000～15000g的条件下离心10～20min，收集滤过液，即得所述滤过物，然后将所述超滤管倒置，于800～1200g的条件下离心10～15min，收集滤过液，即得所述截留物；其中，所述超滤管的截留分子量为3000da。
26.可选地，向所述滤过物中加入冷冻的乙醇，离心后取上清液进行旋蒸，得到以血耳粗多酚为主的小分子提取物的步骤中：
27.所述冷冻的无水乙醇的体积为所述滤过物体积的4～6倍。
28.可选地，向所述滤过物中加入冷冻的乙醇，离心后取上清液进行旋蒸，得到以血耳粗多酚为主的小分子提取物的步骤，包括：
29.向所述滤过物中加入冷冻的无水乙醇，于10000～15000g的条件下低温离心8～12min，收集上清液并于25～37℃下进行旋蒸，得到以血耳粗多酚为主的小分子提取物。
30.可选地，将所述截留物加水溶解稀释，得到以血耳粗多糖为主的大分子提取物的步骤中：
31.将所述截留物加水稀释时的温度为25～37℃。
32.本发明提供的技术方案中，首次提出了一种使用低共熔溶剂从血耳中一次性提取多种活性成分的方法，所述低共熔溶剂是一种绿环保萃取溶剂，同时以超声萃取为辅助手段，从而实现在室温下高效提取出血耳中的多种活性成分，无需进行高温操作或者添加大量有机溶剂，可有效降低工艺能耗、成本以及对环境的污染，并且可最大程度地保留血耳粗提取物的生物活性，同时整个提取方法还具有操作简单、目标产物提取率高的优点。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
34.图1为本发明提供的提取血耳中活性成分的方法的一实施例的流程示意图；
35.图2为本发明提供的提取血耳中活性成分的方法的另一实施例的流程示意图；
36.图3为本发明实施例1和对比例1～2中提取获得的血耳粗多糖的含量对比图；
37.图4为本发明实施例1和对比例1～2中提取获得的血耳粗多糖的抗氧化性对比图；
38.图5为本发明实施例2和对比例3中提取获得的血耳粗多酚的含量对比图；
39.图6为本发明实施例2和对比例3中提取获得的血耳粗多酚的自由基清除活性对比图；
40.图7为本发明实施例2、4～11中提取获得的血耳粗多糖的含量图；
41.图8为本发明实施例3中提取获得的血耳粗多糖在不同浓度下的自由基清除活性对比图。
42.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
43.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案、或b方案、或a和b同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.研究表明，血耳子实体中含有大量的多糖、多酚等生物活性组分。多糖具有丰富的应用价值，可用作食品加工助剂，也作为膳食补充剂，发挥抗肿瘤、降血脂、抗氧化等药理活性。与银耳不同的是，除多糖外，血耳的蛋白含量较高，更具营养价值；更重要的是，血耳中含有大量的血耳素(红褐)，可作为天然着剂，并具有较高的抗氧化活性，能提高食品营养价值、延长食品保存期。然而，血耳多糖、血耳素等生物活性成分的热稳定性较差，例如，血耳多糖在高温、酸性条件下易水解。而常规的提取技术，如针对银耳、木耳中的粗多糖进行提取的酶处理、热水浸提法等均需要较高的提取温度(如50-100℃)下长时间反应，对血耳中的大分子活性物质(如多糖等)及小分子活性物质(多酚类)等均有一定的破坏性，因此不适宜用于血耳多糖等组分的提取。
45.鉴于此，本发明提出一种提取血耳中活性成分的方法，选用低共熔溶剂作为萃取试剂来提取血耳中的活性成分，图1所示为本发明提供的提取血耳中活性成分的方法的一实施例。参阅图1所示，在本实施例中，所述提取血耳中活性成分的方法包括以下步骤：
46.步骤s10、将血耳粉末与低共熔溶剂混合，在室温下对所述血耳粉末进行超声萃取，然后离心并收集上清液，得血耳浸提液；
47.步骤s20、向所述血耳浸提液中加入沉淀助剂，经混匀、静置、离心后取沉淀物，将所述沉淀物洗涤、离心后加入至蒸馏水中进行水浴溶解，得溶解液；
48.步骤s30、采用超滤管对所述溶解液进行过滤，分别得到滤过物和截留物；
49.步骤s40、向所述滤过物中加入冷冻的乙醇，离心后取上清液进行旋蒸，得到以血耳粗多酚为主的小分子提取物；
50.步骤s50、将所述截留物加水溶解稀释，得到以血耳粗多糖为主的大分子提取物。
51.低共熔溶剂(deep eutectic solvents,dess)通常是由氢键受体(hydrogen bond acceptor,hba)与氢键供体(hydrogen bond donor,hbd)通过氢键相互作用所形成的共熔混合物，具有制备方法简单，萃取效率高且易回收等特点，是一种可取代有机试剂的新型绿溶剂。常见的dess多以氯仿胆碱为氢键受体，酸类、酚类、醇类、糖类及无机盐均可作为氢键供体，通过简单的孵育后，氢键受体与供体间可形成具有强氢键的dess。作为萃取溶剂，dess具有多方面的优势，重点包括：(1)具有合适的极性与粘度。无水的dess对于非极性目标物的提取效果比较好，而dess中含有一定比例的水则对于极性目标物的提取效果好，即，合成具有适当含水量的dess，可高效、快速地提取血耳中的多种活性成分，例如一次性提取多糖、蛋白、多酚、黄酮等；(2)室温下不易凝固。与形成dess的氢键受体和供体的物质的熔点、凝固点相比，dess的熔点、凝固点相对较低，使其能适用于在室温进行操作；(3)绿、易回收。
52.经团队研究分析认为，有望以低共熔溶剂作为萃取实际，在室温下一次性提取血耳中的大分子活性组分(如多糖、蛋白等)及小分子活性组分(如多酚、黄铜类等)，并且经过试验验证进一步得到本发明提供的新型提取方法。本发明提供的技术方案中，首次提出了一种使用低共熔溶剂从血耳中一次性提取多种活性成分的方法，所述低共熔溶剂是一种绿环保萃取溶剂，同时以超声萃取为辅助手段，从而实现在室温下高效提取出血耳中的多种活性成分，无需进行高温操作或者添加大量有机溶剂，可有效降低工艺能耗、成本以及对环境的污染，并且可最大程度地保留血耳粗提取物的生物活性，同时整个提取方法还具有操作简单、目标产物提取率高的优点。
53.在本发明的一些实施例中，所述低共熔溶剂的氢键受体为氯化胆碱，所述低共熔溶剂的氢键供体为丙二醇、氯化锌、乙二醇、尿素、丙三醇、聚乙二醇、山梨醇、草酸或柠檬酸。经过试验验证，以上述物质作为所述低共熔溶剂的氢键受体和氢键供体时，均可提取出血耳中的活性成分，对血耳粗多糖的提取效率约为11.2～52.3％，其中，以尿素作为氢键供体时的低共熔溶剂具有最高的多糖提取效率，为52.3％。
54.故而，在本发明的一优选实施例中，选用尿素作为所述低共熔溶剂的氢键供体。进一步地，在该实施例中，所述提取血耳中活性成分的方法还包括制备低共熔溶剂的步骤，也即，参阅图2所示，在步骤s10之前，还包括：
55.步骤s11、以尿素为氢键供体，氯化胆碱为氢键受体，加入去离子水，混匀后于75～85℃下孵育至溶液澄清透明且无晶体析出，得到低共熔溶剂。
56.以尿素为氢键供体，以氯化胆碱为氢键受体，将尿素和氯化胆碱混合后加入去离子水，于75～85℃下水浴搅拌至澄清透明，放置一段时间后，溶液中无晶体析出，即制得所
述低共熔溶剂。相较于有机溶剂而言，低共熔溶剂可由多种无毒无害的组分进行配制，如可使用氯化胆碱作为氢键受体，尿素作为氢键供体，在食品和制药行业具有良好的应用前景；此外，通过过滤、浓缩等方式可轻松回收再生dess，十分符合绿生产的要求。
57.进一步地，在本发明的一些实施例中，步骤s11中所述氢键受体、氢键供体的摩尔比为1:1～4，所述去离子水的质量为所述氢键受体和氢键供体总质量的15～25％。
58.制得所述低共熔溶剂后，将其与血耳粉末混合进行超声萃取，即可得到萃取出血耳多种活性成分在内的血耳浸提液。在本发明的一些实施例中，步骤s10中所述血耳粉末与所述低共熔溶剂的混合比例为：每0.1～1g的所述血耳粉末对应与10～200ml的所述低共熔溶剂混合。
59.优选地，所述血耳粉末为经过机械粉碎后过100目筛所获得的粉末物，有助于提高提取效率。所述血耳粉末的具体制备步骤如下：取一定量的血耳干制品，小心清除表面的灰尘等杂质，置于粉碎机中进行充分粉碎，制成粉料；取一定量制得的粉料，使用孔径为100目的滤网进行过滤，收集过滤得到的粉末物，即制得血耳粉末，置于干燥的容器中备用即可。
60.在本发明的一些实施例中，步骤s10中所述超声萃取的各项参数设置如下：超声波功率为150～650w，超声开启频率为30s/min，即工作30s/停止30s，萃取时间为0.5～2.5h，萃取温度为不高于25℃的室温。由于在超声萃取的过程中会产生一定的热量导致萃取体系的温度升高，因此所述萃取温度不高于25℃可以通过在冰水浴中进行超声萃取来实现，以避免萃取体系温度过高而影响萃取出的活性成分的生物活性。相比于现有酶解、热水浸提等方式需要加热至50～100℃而言，本发明提供的提取方法能够实现在室温下进行提取，大大降低了提取温度，提高了提取所得的血耳活性成分的生物活性，且还能大大降低工艺能耗。
61.所述沉淀助剂的作用是促进所述血耳浸提液中活性成分的沉降，以便于提取分离。具体地，在本发明的一些实施例中，所述沉淀助剂包括无水乙醇和异戊醇，所述无水乙醇和所述异戊醇的体积比为3～5:1。如此组成的所述沉淀助剂对所述血耳浸提液中包括血耳粗多糖和血耳粗多酚在内的多种活性成分具有较好的促沉降效果。
62.进一步地，在本发明的一些实施例中，所述血耳浸提液与所述沉淀助剂的体积比为1:3～5。经过试验验证，在此添加比例下，所述沉淀助剂的添加能够最大程度地促使所述血耳浸提液中包括血耳粗多糖、血耳粗多酚等活性成分的充分沉降。
63.在利用所述沉淀助剂将所述血耳浸提液中的活性成分分离出来之后，将分离出的沉淀物洗涤后加入到蒸馏水中进行水浴溶解，使血耳活性成分重新溶解于水中，以便于后续采用超滤管对大分子活性成分和小分子活性成分进行分离。在本发明的一些实施例中，步骤s30中所述水浴溶解的温度不高于37℃，例如为30～37℃，溶解时间为1～3h。
64.在本发明的一些实施例中，采用超滤管分离出其中大分子活性成分和小分子活性成分的步骤，包括：将所述溶解液置于超滤管中，于10000～15000g的条件下离心10～20min，收集滤过液，即得所述滤过物，然后将所述超滤管倒置，于800～1200g的条件下离心10～15min，收集滤过液，即得所述截留物；其中，所述超滤管的截留分子量为3000da，对应地，所述滤过物为分子量不大于3000da的小分子活性成分，包括血耳粗多酚等，所述截留物为分子量不小于3000da的大分子活性成分，包括血耳粗多糖等。
65.采用超滤管将大分子活性成分和小分子活性成分分离之后，进一步提取分离出小
分子活性成分的步骤包括：向所述滤过物中加入冷冻的无水乙醇，于10000～15000g的条件下低温离心8～12min，收集上清液并于25～37℃下进行旋蒸，得到以血耳粗多酚为主的小分子提取物。
66.进一步地，所述冷冻的无水乙醇的添加量为：所述冷冻的无水乙醇的体积为所述滤过物体积的4～6倍。
67.另外，进一步提取分离出大分子活性成分的步骤包括：将所述截留物在25～37℃的条件下加水溶解稀释，得到以血耳粗多糖为主的大分子提取物。具体可以为在25～37℃的环境温度下将所述截留物与一定量的水混合溶解，即得所述大分子提取物；或者是将所述截留物加入到一定量温度为25～37℃的水中，混合溶解，即得所述大分子提取物。
68.本发明提供的提取方法中，整个过程中的操作温度最高不超过37℃，能够保证提取所得的血耳活性成分的生物活性，且还能大大降低工艺能耗，降低工艺成本和工艺难度。并且，工艺过程中所使用的低共熔溶剂和乙醇溶剂还可以进行回收后进入循环利用，提高了资源的利用率，减少了对环境的影响。
69.以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
70.实施例1
71.(1)以尿素作为氢键供体、氯化胆碱作为氢键受体，按照氢键受体：氢键供体＝1:2的摩尔比混合形成混合液，然后加入占混合液质量20％的去离子水，于80℃下水浴搅拌至溶液澄清透明，放置一段时间后溶液中无晶体析出，得低共熔溶剂。
72.(2)将血耳粉末(机械粉碎后过100目筛)与制得的低共熔溶剂以0.1g：25ml的比例混合，然后将混合物在冰水浴中进行超声萃取，超声波功率为350w，萃取时间1.5h，超声波启停频率为30s/min(即开启30s，停止30s，如此循环至萃取完毕)；萃取完毕后，离心，得血耳浸提液。
73.(3)向制得的血耳浸提液中加入沉淀助剂(无水乙醇与异戊醇按照4:1的体积比混合所得的混合物)，血耳浸提液与沉淀助剂的体积比为1:4，混合均匀后静置，然后离心取沉淀物；对沉淀物进行洗涤、离心，然后加入到去离子水中，于37℃下水浴溶解2h，得溶解液。
74.(4)将制得的溶解液置于超滤管(截留分子量为3000da)中，于14000g下离心20min，收集滤过液，得到滤过物；然后倒置超滤管，于1000g下离心15min，收集滤过液，得到截留物。
75.(5)向得到的滤过物中加入5倍体积的冷冻的无水乙醇，于14000g下低温离心10min，收集上清液，于37℃下旋蒸，得以血耳粗多酚为主的小分子提取物。
76.(6)在37℃下向得到的截留物中加10ml去离子水稀释，得以血耳粗多糖为主的大分子提取物。
77.实施例2
78.(1)以尿素作为氢键供体、氯化胆碱作为氢键受体，按照氢键受体：氢键供体＝1:1的摩尔比混合形成混合液，然后加入占混合液质量15％的去离子水，于75℃下水浴搅拌至溶液澄清透明，放置一段时间后溶液中无晶体析出，得低共熔溶剂。
79.(2)将血耳粉末(机械粉碎后过100目筛)与制得的低共熔溶剂以0.1g：100ml的比例混合，然后将混合物在冰水浴中进行超声萃取，超声波功率为150w，萃取时间2.5h，超声
波启停频率为30s/min(即开启30s，停止30s，如此循环至萃取完毕)；萃取完毕后，离心，得血耳浸提液。
80.(3)向制得的血耳浸提液中加入沉淀助剂(无水乙醇与异戊醇按照3:1的体积比混合所得的混合物)，血耳浸提液与沉淀助剂的体积比为1:3，混合均匀后静置，然后离心取沉淀物；对沉淀物进行洗涤、离心，然后加入到去离子水中，于37℃下水浴溶解1h，得溶解液。
81.(4)将制得的溶解液置于超滤管(截留分子量为3000da)中，于10000g下离心20min，收集滤过液，得到滤过物；然后倒置超滤管，于800g下离心15min，收集滤过液，得到截留物。
82.(5)向得到的滤过物中加入4倍体积的冷冻的无水乙醇，于10000g下低温离心12min，收集上清液，于25℃下旋蒸，得以血耳粗多酚为主的小分子提取物。
83.(6)在25℃下向得到的截留物中加10ml去离子水稀释，得以血耳粗多糖为主的大分子提取物。
84.实施例3
85.(1)以尿素作为氢键供体、氯化胆碱作为氢键受体，按照氢键受体：氢键供体＝1:4的摩尔比混合形成混合液，然后加入占混合液质量25％的去离子水，于85℃下水浴搅拌至溶液澄清透明，放置一段时间后溶液中无晶体析出，得低共熔溶剂。
86.(2)将血耳粉末(机械粉碎后过100目筛)与制得的低共熔溶剂以1g：10ml的比例混合，然后将混合物在冰水浴中进行超声萃取，超声波功率为650w，萃取时间0.5h，超声波启停频率为30s/min(即开启30s，停止30s，如此循环至萃取完毕)；萃取完毕后，离心，得血耳浸提液。
87.(3)向制得的血耳浸提液中加入沉淀助剂(无水乙醇与异戊醇按照5:1的体积比混合所得的混合物)，血耳浸提液与沉淀助剂的体积比为1:5，混合均匀后静置，然后离心取沉淀物；对沉淀物进行洗涤、离心，然后加入到去离子水中，于37℃下水浴溶解3h，得溶解液。
88.(4)将制得的溶解液置于超滤管(截留分子量为3000da)中，于15000g下离心10min，收集滤过液，得到滤过物；然后倒置超滤管，于1200g下离心10min，收集滤过液，得到截留物。
89.(5)向得到的滤过物中加入6倍体积的冷冻的无水乙醇，于15000g下低温离心8min，收集上清液，于30℃下旋蒸，得以血耳粗多酚为主的小分子提取物。
90.(6)在30℃下向得到的截留物中加10ml去离子水稀释，得以血耳粗多糖为主的大分子提取物。
91.实施例4
92.步骤与实施例2相同，不同之处在于，将低共熔溶剂的氢键供体由尿素替换成为丙二醇。
93.实施例5
94.步骤与实施例2相同，不同之处在于，将低共熔溶剂的氢键供体由尿素替换成为氯化锌。
95.实施例6
96.步骤与实施例2相同，不同之处在于，将低共熔溶剂的氢键供体由尿素替换成为乙二醇。
97.实施例7
98.步骤与实施例2相同，不同之处在于，将低共熔溶剂的氢键供体由尿素替换成为丙三醇。
99.实施例8
100.步骤与实施例2相同，不同之处在于，将低共熔溶剂的氢键供体由尿素替换成为聚乙二醇。
101.实施例9
102.步骤与实施例2相同，不同之处在于，将低共熔溶剂的氢键供体由尿素替换成为山梨醇。
103.实施例10
104.步骤与实施例2相同，不同之处在于，将低共熔溶剂的氢键供体由尿素替换成为草酸。
105.实施例11
106.步骤与实施例2相同，不同之处在于，将低共熔溶剂的氢键供体由尿素替换成为柠檬酸。
107.对比例1
108.采用热水浸提法对0.1g血耳进行粗提取，提取流程按照专利cn112940146a，《一种银耳多糖制备方法》。
109.对比例2
110.采用酶法对0.1g血耳进行粗提取，提取流程按照专利cn112778434a，《一种银耳多糖及其提取方法》。
111.对比例3
112.采用实施例1中的方法对银耳(提取原料为银耳干粉)进行粗提取。
113.对上述实施例和对比例制得的提取物进行相关测试，测试方法如下：
114.(1)血耳多糖含量测定，采用苯酚-硫酸法，步骤如下：
115.a、标准曲线的制作：准确称取标准葡萄糖(分析纯，已充分干燥)20mg于500ml容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，配置0.1mg/ml葡萄糖标液，分别吸取0ml、0.3ml、0.6ml、0.9ml、1.2ml、1.5ml，以蒸馏水定容到1.5ml，然后加入6wt％苯酚1.5ml、浓硫酸7.5ml，摇匀，置于80℃反应30min，冷却至室温后490nm下测吸光度，蒸馏水做对照。以葡萄糖浓度(c)为横坐标，吸光度(a)为纵坐标，制作标准曲线。葡萄糖标准曲线a＝8.1217c+0.0286，r2＝0.9994，其中：a为吸光度值，c为葡萄糖浓度(mg/ml)，r2为相关系数；
116.b、血耳粗多糖含量的测定：将血耳粗多糖提取物的复融溶液稀释10倍后，取1.5ml稀释液加入6wt％苯酚1.5ml，浓硫酸7.5ml，摇匀，置于80℃反应30min后冷却至室温，测定490nm的吸光度值a，根据标准曲线计算发酵液中多糖含量；
117.其中，血耳多糖提取率按照以下公式计算：
118.血耳多糖提取率(％)＝100
×
c％(g/g)，
119.式中，c为对提取液进行10倍稀释后的血耳多糖的浓度。
120.(2)血耳粗多糖提取物中蛋白质含量测定，采用福林酚试剂法，步骤如下：
121.a、用牛血清白蛋白(下称bsa)绘制标准曲线：将牛血清白蛋白用浓度为0.15m的氯
化钠溶液配制成0.25mg/ml的bsa标准溶液。取6支试管，分别加入bsa标准溶液0ml、0.05ml、0.1ml、0.15ml、0.2ml、0.25ml，用0.15m氯化钠溶液补齐至1ml。分别加入配置好的反应试剂a1.25ml，充分混合并于室温下静置10min，0.125ml反应试剂b(福林酚试剂)，立即混匀，于室温下反应30min，将反应物于500nm波长下测定吸光值。以吸光值作为纵坐标，蛋白质含量为横坐标绘制标准曲线。而后加入使用紫外可见分光光度计在波长为500nm处测定相应的吸光度值，并绘制牛血清白蛋白标准曲线。标准曲线方程为：a＝1.682+0.0066，r2＝0.9941，牛血清白蛋白的含量c(mg/ml)为横坐标，吸光度值a为纵坐标，r2为相关系数；
122.反应试剂a的配置：a1:4％碳酸钠溶液(称2g到50ml)；a2:0.2mol/l氢氧化钠溶液(称0.4g到50ml)；a3:1％硫酸铜溶液(称0.5g到50ml)；a4:2％酒石酸钾钠溶液(称2g到50ml)；使用前将a1与a2等体积配制碳酸钠-氢氧化钠溶液；a3与a4等体积配制成硫酸铜-酒石酸钾钠溶液。将碳酸钠-氢氧化钠溶液与硫酸铜-酒石酸钾钠溶液按50:1的比例配合，即成folin-酚试剂反应a(现配现用)。
123.反应试剂b的配置：称钨酸钠100g，钼酸钠25g置2000ml磨口回流装置内，加蒸馏水700ml，85％磷酸50ml和浓硫酸100ml。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h(烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出)，再加入硫酸锂(liso4)150g，蒸馏水50ml及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000ml，过滤即成folin-酚反应试剂b，此液应为鲜黄。在4℃冰箱中避光保存。
124.b、蛋白质含量的测定：取0.25ml血耳粗多糖提取液的10倍稀释溶液，加入1.25ml试剂甲，混匀并于25℃静置10min；而后加入0.125ml试剂乙，立即摇匀，于25℃反应30min，测定吸光值，从标准曲线查出样品蛋白质含量。
125.其中，蛋白质的含量采用如下公式进行计算：
126.蛋白质含量(100％)＝10
×
c/0.1(g/g)；
127.式中，c为提取后10ml血耳粗多糖溶液中的蛋白质浓度。
128.(3)血耳粗多酚提取物中多酚含量测定，采用folin-ciocalteau法，步骤如下：
129.a、标准曲线的制定：准确称取真空干燥至恒重的没食子酸对照品100mg，用水溶解并定容至100ml，配成浓度为1mg/ml的没食子酸原液。取原液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml加入到10ml容量瓶中，用蒸馏水定容到10ml，配成浓度为10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml的没食子酸溶液。分别取上述不同浓度溶液1ml加到试管中，然后依次加入2ml蒸馏水、0.5ml folin-ciocalteau试剂，1ml 20％na2co3溶液，室温下反应30min，在760nm下测定其吸光度。由吸光度对没食子酸加入量进行回归，求得标准曲线。没食子酸浓度为横坐标(c，μg/ml)，吸光值为纵坐标。标准曲线为：a＝0.0232c+0.0753，r2＝0.9985。
130.b、血耳粗多糖中多酚含量的测定：吸取1ml的血耳粗多酚提取物到试管中，然后依次加入2ml蒸馏水、0.5ml folin-ciocalteau(福林酚)试剂(实验室配置)、1ml 20％na2co3溶液，室温下反应1h，在760nm下测定其吸光度。将测得的吸光度代入标准曲线，求得提取物中总多酚。
131.多酚含量(100％)＝c/0.1(g/g)；
132.式中，c为提取后1ml血耳粗多酚溶液中的多酚浓度。
133.(4)血耳粗多糖提取物的抗氧化性测定仪对dpph自由基的清除率进行测定，方法
参考国家标准gb/t 39100-2020《多肽抗氧化性测定dpph法》。
134.以实施例1和对比例1-2进行比较，分析不同的提取方式对0.1g血耳样品进行多糖提取的多糖提取率及抗氧化性的影响，图3所示为不同提取方式的多糖提取率，图4所示为不同提取方式所得血耳多糖的抗氧化性。
135.由图3的结果可知，热水浸提法、酶法以及本发明实施例提供的方法均能有效地提取血耳粗多糖，热水浸提法的多糖提取效率约为35％，酶法提取血耳粗多糖的多糖提取效率约为53％，本发明实施采用低共熔溶剂提取的多糖提取效率约为50％，说明酶法和低共熔溶剂提取血耳粗多糖的效率较高，而采用热水浸提法进行血耳粗多糖提取的效率较低。
136.由图4可以看出，采用本发明实施例提供的低共熔溶剂萃取法所提取的多糖提取物具有较高的自由基清除活性，达到71％，而采用热水浸提法或酶法所获得多糖提取物的自由基清除能力较低，推测这可能与提取过程中的提取温度有着密切关系，本发明实施例采用的提取方法温度自始至终未高于37℃，而采用热水浸提法的提取温度可达到90℃，采用酶法提取的提取温度可达到50℃，可能是高温对血耳多糖或其他生物活性组分具有较强的破坏作用或加速其氧化，而本发明实施例提供的方法则可以实现在室温下高效提取血耳多糖，更能够保证其具有较高的生物活性。
137.以实施例2和对比例3进行比较，分析本发明提供的提取方法对血耳和银耳进行提取时，所得到的多糖含量、蛋白含量、多酚含量及其抗氧化性变化。经测定，血耳粗多糖中，粗多糖提取率约为52.3％，血耳粗蛋白提取率约为8％；银耳粗多糖提取率约为45％，银耳粗蛋白提取率约为5％。
138.图5所示为血耳粗多酚提取物以及银耳粗多酚提取物中的多酚含量。由图5(图5中，tfp-pp为银耳多酚，tsp-pp为血耳多酚)可知，血耳多酚和银耳多酚的含量均较低，与文献报道一致，但血耳中的多酚含量显著高于银耳。
139.图6所示为血耳粗多酚提取物和银耳粗多酚提取物的抗氧化活性对比。由图6(图6中，tfp-pp为银耳多酚，tsp-pp为血耳多酚)可知，本发明实施例提取所得的血耳粗多酚提取物具有较高的抗氧化活性，推测这可能与选取低共熔溶剂作为萃取试剂的优良特性有关，说明该试剂可在常温下高效地提取血耳中的多酚类物质。
140.以实施例2与实施例4-11进行比较，分析选取不同的氢键供体对血耳粗多糖提取效果的影响。图7所示为分别采用丙二醇(propylene glycol)、氯化锌(zinc chloride)、乙二醇(ethylene glycol)、尿素(urea)、丙三醇(glycerol)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、山梨醇(sorbitol)、草酸(oxalic acid)和柠檬酸(citric acid)作为氢键供体时血耳多糖的提取效率。
141.由图7可知，上述9中物质作为氢键供体配制所得的低共熔溶剂均可优选实现血耳多糖的提取，提取效率为11.2～52.3％，其中，以尿素作为氢键供体时制备所得的低共熔溶剂具有最高的多糖提取效率，为52.3％。
142.测试实施例3制得的血耳粗多糖提取物中的多糖含量，为51.7％。根据溶液中多糖的浓度，将溶液进行稀释，得到多糖浓度分别为0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml的血耳粗多糖溶液，分别测定各浓度下血耳粗多糖溶液的抗氧化活性，测试方法参考国标gb/t39100-2020中的方法，选择vc(浓度范围0.1-1.0mg/ml)作为参照物，结果如图8所示。
143.由图8可以看出，所选的对照(自由基清除实际，vc)能有效清除自由基，表面自由基清除实验能够正常进行。以血耳粗多糖提取物稀释溶液所进行的自由基清除实验结果表明，各稀释液均具有一定的自由基清除活性，且随着血耳粗多糖浓度的提高，自由基清除活性增强。
144.以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：

1.一种提取血耳中活性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：将血耳粉末与低共熔溶剂混合，在室温下对所述血耳粉末进行超声萃取，然后离心并收集上清液，得血耳浸提液；向所述血耳浸提液中加入沉淀助剂，经混匀、静置、离心后取沉淀物，将所述沉淀物洗涤、离心后加入至蒸馏水中进行水浴溶解，得溶解液；采用超滤管对所述溶解液进行过滤，分别得到滤过物和截留物；向所述滤过物中加入冷冻的乙醇，离心后取上清液进行旋蒸，得到以血耳粗多酚为主的小分子提取物；将所述截留物加水溶解稀释，得到以血耳粗多糖为主的大分子提取物。2.如权利要求1所述的提取血耳中活性成分的方法，其特征在于，所述低共熔溶剂的氢键受体为氯化胆碱，所述低共熔溶剂的氢键供体为丙二醇、氯化锌、乙二醇、尿素、丙三醇、聚乙二醇、山梨醇、草酸或柠檬酸。3.如权利要求1所述的提取血耳中活性成分的方法，其特征在于，将血耳粉末与低共熔溶剂混合，在室温下对所述血耳粉末进行超声萃取，然后离心并收集上清液，得血耳浸提液的步骤之前，还包括：以尿素为氢键供体，氯化胆碱为氢键受体，加入去离子水，混匀后于75～85℃下孵育至溶液澄清透明且无晶体析出，得到低共熔溶剂。4.如权利要求3所述的提取血耳中活性成分的方法，其特征在于，以尿素为氢键供体，氯化胆碱为氢键受体，加入去离子水，混匀后于75～85℃下孵育至溶液澄清透明且无晶体析出，得到低共熔溶剂的步骤中：所述氢键受体、氢键供体的摩尔比为1:1～4，所述去离子水的质量为所述氢键受体和氢键供体总质量的15～25％。5.如权利要求1所述的提取血耳中活性成分的方法，其特征在于，将血耳粉末与低共熔溶剂混合，在室温下对所述血耳粉末进行超声萃取，然后离心并收集上清液，得血耳浸提液的步骤中：每0.1～1g的所述血耳粉末对应与10～200ml的所述低共熔溶剂混合；和/或，所述血耳粉末的目数不小于100目；和/或，所述超声萃取的超声波功率为150～650w，超声开启频率为工作30s/停止30s，萃取时间为0.5～2.5h，萃取温度为不高于25℃的室温。6.如权利要求1所述的提取血耳中活性成分的方法，其特征在于，向所述血耳浸提液中加入沉淀助剂，经混匀、静置、离心后取沉淀物，将所述沉淀物洗涤、离心后加入至蒸馏水中进行水浴溶解，得溶解液的步骤中：所述沉淀助剂包括无水乙醇和异戊醇，所述无水乙醇和所述异戊醇的体积比为3～5:1；和/或，所述血耳浸提液与所述沉淀助剂的体积比为1:3～5；和/或，所述水浴溶解的温度不高于37℃，溶解时间为1～3h。7.如权利要求1所述的提取血耳中活性成分的方法，其特征在于，采用超滤管对所述溶解液进行过滤，分别得到滤过物和截留物的步骤，包括：将所述溶解液置于超滤管中，于10000～15000g的条件下离心10～20min，收集滤过液，
即得所述滤过物，然后将所述超滤管倒置，于800～1200g的条件下离心10～15min，收集滤过液，即得所述截留物；其中，所述超滤管的截留分子量为3000da。8.如权利要求1所述的提取血耳中活性成分的方法，其特征在于，向所述滤过物中加入冷冻的乙醇，离心后取上清液进行旋蒸，得到以血耳粗多酚为主的小分子提取物的步骤中：所述冷冻的无水乙醇的体积为所述滤过物体积的4～6倍。9.如权利要求1所述的提取血耳中活性成分的方法，其特征在于，向所述滤过物中加入冷冻的乙醇，离心后取上清液进行旋蒸，得到以血耳粗多酚为主的小分子提取物的步骤，包括：向所述滤过物中加入冷冻的无水乙醇，于10000～15000g的条件下低温离心8～12min，收集上清液并于25～37℃下进行旋蒸，得到以血耳粗多酚为主的小分子提取物。10.如权利要求1所述的提取血耳中活性成分的方法，其特征在于，将所述截留物加水溶解稀释，得到以血耳粗多糖为主的大分子提取物的步骤中：将所述截留物加水稀释时的温度为25～37℃。

技术总结

本发明公开一种提取血耳中活性成分的方法，包括以下步骤：将血耳粉末与低共熔溶剂混合，在室温下对所述血耳粉末进行超声萃取，然后离心并收集上清液，得血耳浸提液；向所述血耳浸提液中加入沉淀助剂，经混匀、静置、离心后取沉淀物，将所述沉淀物洗涤、离心后加入至蒸馏水中进行水浴溶解，得溶解液；采用超滤管对所述溶解液进行过滤，分别得到滤过物和截留物；向所述滤过物中加入冷冻的乙醇，离心后取上清液进行旋蒸，得到以血耳粗多酚为主的小分子提取物；将所述截留物加水溶解稀释，得到以血耳粗多糖为主的大分子提取物。本发明以低共熔溶剂作为萃取溶剂，同时以超声萃取为辅助手段，从而实现在室温下高效提取出血耳中的多种活性成。活性成。活性成。