杨寿慧;刘惟优
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【摘 要】9547900
结核病是由结核分枝杆菌引起的一种威胁全球健康的传染性疾病.是结核病应用最广泛的药物之一.前体通过过氧化氢-过氧化物酶(KatG)激活,活化的可抑制靶蛋白InhA.耐药的分子机制涉及多个基因,其中katG基因突变是耐药主要的原因,另外还有inhA、kasA、oxyR基因等.外排泵系统在耐药方面也起着重要作用.了解抗结核分枝杆菌作用机制及结核分枝杆菌耐的分子机制将有助于耐药结核病的诊治. 【期刊名称】《医学研究生学报》
【年(卷),期】2018(031)010
电容器串联【总页数】5页(P1086-1090)
【关键词】结核分枝杆菌;;耐药机制
【作 者】杨寿慧;刘惟优
【作者单位】341000 赣州,赣南医学院第一附属医院呼吸科;341000 赣州,赣南医学院第一附属医院呼吸科
【正文语种】中 文超滤器
【中图分类】R516
0 引 言
结核病是由结核分枝杆菌引起的长期以来威胁人类健康的传染性疾病。据世界卫生组织估计2015年全世界约有1040万新发结核病例，我国新发人数仅次于印度和印度尼西亚位高居全球第3位[1]。作为一种典型的持留菌，体内潜伏感染的结核分枝杆菌难以清除并且有很强的耐药突变潜力[2]。目前结核病上应用最广泛的一线抗结核药物是异胭肼，但随着耐药结核菌的增加，使得患者不得不更换昂贵且副作用大的二线抗结核药物。结核病方案的选择常常需要依据药敏结果，但传统药敏培养时间一般长达4～8周。值得关注的是近年来分子生物学在结核菌耐药检测方面取得一些重要的进展，为结核
分枝杆菌耐药检测提供了新思路。
1 及其对结核分枝杆菌的作用机制
结核分枝杆菌的细胞壁由长链分枝菌酸、高支链的阿拉伯多糖、肽聚糖组成的交叉连接网3个主要的组成成分。是作用于结核分枝杆菌细胞壁分枝菌酸合成的窄谱抗生素。从1952年开始作为抗结核药物应用于临床，其结构仅一个吡啶环连接一个酰肼基。结核分枝杆菌对异胭肼敏感，最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)为0.15～0.44 μmol/L。异胭肼作为一种前体药物需经过氧化反应才能变得有活性，它的最终靶标是抑制参与结核分枝杆菌细胞壁生物合成的烯酰基载体蛋白还原酶InhA。 InhA是脂肪酸合酶II型系统的必需酶，可以将脂肪酸合酶I型系统的C16-C18脂肪酸顺序延伸至C56，从而产生菌酸前体，该前体是分枝杆菌包膜的主要脂质。在脂肪酸合酶II型系统中，InhA以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅因子为供氢体，催化脂肪底物羰基共轭的反式双键的还原。异胭肼抑制InhA从而阻止脂肪酸的伸长，最终导致结核菌死亡[3]。
前体异胭肼通过结核分枝杆菌KatG过氧化物-过氧化氢酶活性转换为有活性中间体异烟碱
酰自由基，异烟碱酰自由基共价结合到NADH辅酶，在单电子还原之后形成活性代谢产物-NADH加合物，-NADH加合物便会缓慢及紧密结合InhA[4]。
2 耐药的katG基因相关机制
在临床中，结核病发病率可能与特定区域人特殊免疫基因对结核菌的易感性相关[5]。结核病患者由于抗生素不当引起、剂量不足或者疗程不够，结核分枝杆菌在阳性选择压力下发生基因突变，使得耐药结核菌形成。katG基因突变发生在31.8%～96.9%的结核分枝杆菌耐药菌株中，而且常常与高水平耐药有关[6]。katG基因是结核分枝杆菌染体上的一个功能区段，全长2223 bp，编码的KatG蛋白由744个氨基酸残基所构成。其突变大多数发生在138～328位密码子之间。其中以315密码子最为多见，最常见的是G-C (AGC-ACC)替代，结果导致丝氨酸转变成苏氨酸(S315T)。该位点其他形式突变及相应的氨基酸改变分别有ACA (Thr)、ATC(Ile)、AGA (Arg)、AGG (Arg)、CGC (Arg)、 AAC (Asn)和 GGC (Gly)。而不同地理位置katG基因315位点突变频率也不尽同，南非见于97%的耐药菌株中，86%～94%见于俄罗斯、立陶宛和拉脱维亚，60%～87%见于巴西，约65%见于澳大利亚、中国和科威特，荷兰为53%，西班牙为46%，意大利为38%，
约28%见于日本，7%见于芬兰患者，韩国和美国最低为4%[7]。我们的一项研究表明：77株来自江西地区耐多药结核杆菌的katG基因315位点突变率约为60%(46/77)[8]。由此表明检测katG基因315位点来预测结核菌耐药情况各个地区差异很大，315位点突变高发地区仅仅检测315位点即可检测出大部分的耐药菌株，但也有相当一部分地区315位点突变率很低，这就要求继续探寻可能导致耐药的其他突变位点。当然，并不是所有的位点突变都会引起耐药，有些突变可能是代偿突变，有些突变仅是基因多态性。
尽管在耐药菌株中可能检测到1个或以上的突变位点，但哪些突变位点与耐药存在必然的联系并不清楚，即不能完全通过检测分子突变就判断耐药。国内外研究学者在这方面做出了不懈的努力。Brossier等[9]将临床结核菌对表型耐药情况划分为3个等级，即低水平(0.1 mg/L<MIC<1 mg/L)、高水平(1 mg/L<MIC<10 mg/L)、极高水平(MIC≥10 mg/L)，并检测16个不同突变位点KatG纯化蛋白的过氧化氢酶活性、过氧化物酶活性、自由基产物活性、-NAD形式酶活性。同时根据蛋白酶检测活性情况分成6个组：第1组为极高水平耐药，如KatG H270R突变体则完全丧失KatG蛋白酶活性。第2组R595STOP、L336P、W341G和G118D 这4个突变体酶活性均大幅下降，它们的过氧化氢酶活性几乎为零，表现为极高水平耐药，而G121D自由基活性相当低，过氧化
物酶活性及-NAD酶活性也显著下降，其表型为高水平耐药。第3组则以突变位点S315T和A162E为代表，主要特点是这两个突变体自由基产物活性急剧减少，它们的-NAD酶活性也明显下降，而且其过氧化氢酶酶活性下降30%～45%，表型均为高水平耐药。第4组中G494D、Q461P,D189G、R249H、F658V这5个突变体主要表现为酶活性部分丧失，过氧化氢酶活性及自由基产物活性变化范围43%～88%。其中G494D表型为高水平耐药，而Q461P,D189G、R249H、F658V表型均为低水平耐药。第5组突变体表型为低水平耐药，如KatG A110V显示过氧化氢酶和自由基产物活性降低20%～30%。第6组为基因遗传多态性，如R463L表型为完全敏感菌株，该突变体自由基产物活性没有任何变化，过氧化氢酶、过氧化物酶及-NAD酶3种酶活性仅轻度下降。
我国学者对耐药菌株测得KatG W328F引起酶活性部分缺失，而KatG M420T则认为是代偿性进化[10]。其相邻的KatG N329V位点，测得KatG过氧化氢酶活性完全丧失，但仍保持一定的过氧化物酶活性[11]。早期Mo等[12]对耐药菌株KatG R418Q, S315T和W321G突变酶活性检测结果：S315T过氧化氢酶、过氧化物酶活性分别下降83%和86%；W321G过氧化氢酶活性为零，过氧化物酶活性下降94%；R418Q过氧化氢酶活性为零，过
氧化物酶活性下降85%。根据作用机制不难分析，若菌株表型为高水平耐药株并且突变位点唯一，纯化相应KatG酶活性降低明显，便可认为该位点极有可能是基因检测耐药的有效位点。但KatG酶活性下降程度与结核分枝杆菌耐药程度之间关系的确定有待进一步探讨。目前各地对katG突变位点的检测情况相继报道，我们课题组前期研究对江西77株耐药菌株测序发现katG(W191Stop，T271P，W328F，L546P，D695G)5个既往尚未报道的突变位点[8]，除W328F位点已测得酶活性变化外[10]，其余突变位点相应的酶活性变化需要进一步深入研究。
3 耐药的其他基因相关机制
inhA编码烯酰基乙酰载体蛋白还原酶(NADH依赖的enoyl-ACP还原酶),蛋白相对分子质量为32 000。在不同的研究中，12%～42%耐菌株存在inhA启动子区突变。特别是inhA启动子区C(-15)T, T(-8)G/A, A(-16)G突变使inhA过表达,使结核分枝杆菌表型为低水平异胭肼耐药(MIC<1 mg/L)。大量研究数据表明：InhA的突变常发生在启动子区域，而不是结构区域的突变[13]。
另有kasA、oxyR、ahpC、ndh也参与结核耐药。kasA编码的KasA(β-酮脂酰基ACP合成酶)
能促进分枝菌酸的生物合成。oxyR编码的OxyR调节子为氧压力调节蛋白。但结核分枝杆菌katG的表达不受OxyR的调控，即此基因在结核分枝杆菌中没有功能。当KatG蛋白酶活性下降时，可促使ahpC启动子突变从而增强ahpC基因表达，进而代偿性抵抗宿主巨噬细胞的氧化作用。ndh编码呼吸链中NADH脱氢酶，ndh基因突变降低NADH氧化速率及增加细胞内NADH/NAD+的比例，细胞内NADH数量的积累，可能竞争性抑制-NADH加合物结合到inhA上。这些基因具体位点突变与临床耐药关系目前并不十分确切，有待进一步研究[14]。
电子管话筒4 耐药的外排泵相关机制
结核分枝杆菌耐药另一类机制为外排泵作用，结核菌外排泵基因高表达外排泵后可将菌内药物泵出细菌外，导致菌内药物浓度降低，诱导细菌耐药。根据药物外排机制的不同，细菌外排泵可分为6个超家族，其中易化子超家族、ATP结合盒超家族、耐药结节化细胞分化超家族、小耐多药性家族4个超家族见于结核菌外排泵。ATP结合盒超家族家族利用ATP水解自由能量排出药物。易化子超家族、小耐多药性家族、耐药结节化细胞分化超家族是利用质子或钠离子的跨膜电化学梯度辅助排出药物。有学者应用定量逆转录-聚合酶链反应技
术对结核分枝杆菌临床分离株进行基因表达研究，结果表明：结核分枝杆菌易化子超家族转运蛋白(Rv1634，Rv1250，Rv2265，Rv0849，efpA[Rv2846c], Rv1258c, jefA[Rv2459]和P55[Rv1410c])、ATP结合盒超家族转运蛋白(Rv0194，Rv1819c，Rv1218c和pstB[Rv0933])和耐药结节化细胞分化超家族转运蛋白(Rv0507)在异胭肼存在的诱导条件下高表达[15-19]。这些结果表明结核分枝杆菌对异胭肼的耐药性可能受外排相关机制的影响或调节。
在结核分枝杆菌中，尽管已经报道了几种过表达外排泵，但它们对临床耐药的作用大小仍有待于进一步确定。为此，学者们对具体的基因功能与耐药关系进行了深入的研究。通过基因敲除实验表明：iniA(Rv0342)基因是外排泵活性所必需基因，可以导致结核分枝杆菌耐和乙胺丁醇[20]。Gupta等[21]对结核分枝杆菌可能的药物外排蛋白jefA(Rv2459)进行探讨，他们克隆基因片段后利用大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭载体转化入结核分枝杆菌H37Rv并过表达，证实此基因可使菌株MIC增加。科研人员也注意到耐药结节化细胞分化超家族转运蛋白mmpL7在耻垢分枝杆菌中过表达后直接将药物外排出细胞壁，表现出对高水平耐药[22]。并且mmpL家族的mmpL3参与分枝杆菌存活必须的霉菌酸的转运，并介导多种离子或中性化合物以及重金属和脂肪酸的转运，由此推测该
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基因也与外排耐药有关。然而Unissa等[23]通过对100例结核分枝杆菌临床分离株耐药基因测定后，认为在异胭肼耐药方面，与katG和inhA基因突变所致耐药主要贡献相比，外排泵mmpL3、mmpL7的作用并不明显，并且这两基因突变与katG、inhA和nat基因突变没有相关性。另一个转运蛋白即小耐多药性家族的Mmr(Rv3065)也引起科研人员的关注，先前报道该蛋白参与了耻垢分枝杆菌几种化合物如红霉素等的外排作用[24]。然而Rodrigues等[25]通过对Mmr(Rv3065)缺失和过表达进一步对此基因与耐药和其他药物相互作用关系进行研究，发现该基因主要对季铵化合物如溴乙锭等敏感，但该基因缺失或过表达对的药物敏感性并无影响，因此其对结核分枝杆菌耐药作用有待进一步验证。
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