摘要：体外构建的细胞-支架复合物植入体内后，距支架边缘200μm以上的细胞会存在营养供应不足，必须得到血运系统重建才能成活；另外，血液中的生长因子或促生长物质可刺激干细胞成熟分化，促进组织形成。因此组织支架的血管化是骨组织工程的关键技术。本研究采用最近提出的低温沉积制造技术来制造组织支架，并测试其力学性能和生物学性能。得到最优化的组织支架的制备参数和微观形貌要求，为临床实验提供必备的基础。
关键词：骨组织工程；低温沉积制造；血管化
1、引言
1.1骨组织工程
组织工程学是八十年代末开始发展起来的一门新兴学科，它涉及到临床医学、生物材料学、细胞生物学、分子生物学和生物工程等为基础的一系列学科，其目的是生成可替代性的组织
和器官，以修复受损害的组织与器官的功能。[1]然而迄今为止，作为组织工程研究最为活跃的领域之一，骨组织工程的研究与应用仅限于在小而薄的骨缺损修复方面取得一定进展。从临床看，由各种创伤、感染和恶性肿瘤等造成的大范围、大节段骨缺损较常见，其修复一直是临床实际应用中面临的难题。在研究中，种子细胞、支架材料与活性因子作为骨组织工程的三要素，也是生物组织的三个基本成分。[2]
有学者在1976年发现骨髓中的部分细胞可分化成骨[3]，1987年又有学者证实骨髓间充质干细胞具有多向分化的潜能[4]。目前对这些细胞已经有了更加深刻的研究与认识，种子细胞是一种能够促进组织和器官生长的功能性细胞，它的选取和利用是骨组织工程研究中的关键环节。在骨组织工程中，理想的种子细胞的要求主要为：①适合临床应用、取材容易、创伤区域小；②具有明确的成骨能力；③安全性好，可避免免疫排斥反应。在应用中主要包括成体干细胞和胚胎干细胞，其中骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、脐带与脂肪来源性干细胞在实验与临床的研究中最为突出[5]。方小魁、杨杜明等人在文献[6，7]中介绍了种子细胞在骨组织工程中的最新研究进展。
支架材料是为种子细胞提供适合其生长的场所和发挥生物学功能的一种生物学材料，具
有能模仿天然组织的构建性能。[8]作为种子细胞的生物学载体，理想的支架材料应具如下特征：①良好的生物相容性；②适中的生物降解性；③具有骨诱导或引导组织再生的能力；④具有一定的生物力学强度与可塑形性；⑤无毒性与无免疫原性；⑥具有合适的孔径，利于细胞黏附生长等特点。目前国内外研究的支架材料种类众多，主要有两大类：一类是天然生物衍生材料，主要有脱钙脱细胞骨基质、壳聚糖、藻酸盐凝胶等；另一类是人工合成生物高分子材料，主要有羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃等无机材料和以聚乳酸及其共聚物等为代表的有机材料。黄霞等人在文献[9]中介绍了骨组织工程支架材料的最新研究进展。赵玫等人在文献[10]中详细介绍了纳米羟基磷灰石复合支架材料在骨组织工程中的研究现状及国内外现状。
s8003 生物活性因子是一类调节细胞生长和增殖的多肽类物质，对促进组织器官的修复和再生有重要作用，骨基质中含有多种生长因子，骨再生的过程是由一个复杂的细胞因子共同调控，在骨的形成、吸收和重建中起重要作用。[11]目前应用于骨组织工程的生物活性因子主要有以下几种：骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍化生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子-β等。[12]周苗等人在文献[13]中详细
介绍了重组骨形态形成蛋白（recombinants human bone morphogenetic proteins，组合式桥架rhBMPs）在修复下颌骨缺损的动物实验中的国内外现状和最新的研究进展。
FFU净化单元在骨组织工程研究中，移植物的免疫排斥依然是骨移植的首要问题。其次，支架材料尚有许多问题有待解决，如支架材料的降解速率可控性差；材料的机械力学强度很难达到修复组织的最佳要求；支架应用中的最适孔径和孔隙率还不清楚等。另外，在骨组织工程中修复组织的血管化与神经化差依然是需解决的难题。骨组织工程自体来源的种子细胞数量较少难以满足临床需要，但其它来源的种子细胞还没有在临床应用上得到广泛的研究证实，它仍是构建组织工程骨的一个瓶颈。[14-17]
随着各种生物支架材料的大量研究，长节段三维支架材料、生物材料的相容性、材料的血管神经化等都将成为在支架材料方面研究的热点与重点，特别是多种复合材料与纳米材料的研究，将使得组织工程骨具有更优越的性能；在种子细胞方面，胚胎干细胞将作为组织工程学的研究重点，为人们在组织工程方面的临床应用提供更为广阔的选择。[18,19]总之，结合组织工程学原理和现代高科技对病损组织器官进行修复，超越了以往人们观念中的组织器官修复重建的思维模式，现在更有学者提出了把再生医学作为一门新兴学科的概
念，为组织与器官的修复重建带来了一场理论和技术上的革新，是一种全新的研究和策略。
1.2 低温沉积制造
低温沉积制造（Low-temperature Deposition Manufacturing,LDM）是由清华大学提出的一种将材料的挤压/喷射过程和热致相分离过程集成起来的快速成形新工艺。[20]相比其它快速成形工艺，LDM存在以下特点:[21,22]
(l)是材料的挤压/喷射与热致相分离过程相集成的工艺，综合了两种工艺各自的优点，克服了各自的不足。在成形室中，通过一次成形，实现既包含大孔又包含微孔的分级结构。
(2)可以很好的保持材料的生物学性能，具有更广泛的材料适应性。在工艺过程中，材料始终在室温或低于室温的环境下处理，有利于保证材料原有的理化性能，生物学性能不受影响。
(3)可以成形复杂的非均质材料支架。通过多喷头技术，可以实现复杂非均质材料的成分梯
度;由于采用基于挤压/喷射的工艺原理，不需去除多余材料，可以实现复杂非均质材料的精细的孔隙结构梯度。
LDM的系统构成包括软件系统和硬件系统两部分，分别进行数字模型的建立和实体支架的成形制造。软件部分由三维重构或者CAD生成目标物的轮廓模型(STL);对STL文件进行检验和修正后，按照大孔结构信息将其分层，并进行层片内的填充处理，生成层片文件(SLI，CLI);经检验/修正后转换成可以驱动硬件系统的扫描矢量。硬件部分包括喷头模块、扫描运动模块和成形室模块三部分。喷头模块实现浆料的送进和挤压/喷射。扫描运动模块实现喷头在XY平面内的扫描运动和喷头与工作台面在Z方向上的相对运动，保证从喷嘴出来的材料的精确堆积。成形室模块为整个成形过程提供可控的低温环境，保证从喷头出来的材料适时冷却固化。蛇油精[22,23]
低温快速成形（LT-RP）技术是具有宽广应用前景的绿制造技术，在RP与绿制造相结合的领域，占据重要的地位。[24]
1.3组织支架血管化
组织工程骨经过大量试验研究证明是修复骨缺损较理想的方法和未来的研究方向，但在临床应用方面仍不理想。主要原因就是受制于组织工程骨血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失败。[25]组织工程骨血管化贯穿整个移植修复过程，对骨再生与融合的方式及效果起决定性作用。[26]研究表明，单纯组织工程学方法构建出的组织工程骨厚度不能大于0. 7 mm，仅能培养出微小的颗粒状组织工程骨，否则骨块中心的成骨细胞将因缺少营养而死亡，因此使其应用受到了明显限制。电视升降机[27]由此可见充足的营养对于组织工程骨的构建至关重要，组织工程骨血管化是解决其营养和代谢的唯一途径。[28]
根据血管发生中内皮细胞的来源不同，将血管发生分成血管生成和血管再生。[29]前者指血管内皮细胞来源于其前体细胞——成血管细胞( 干电池手机内皮祖细胞) ，这种血管形成方式主要是指在胚胎发育时，由中胚层的成血管细胞发育成血管系统。后者是指血管的生长来源于已经存在的微血管内皮细胞，血管再生是通过已经存在的血管通过出芽及微血管融合生长等方式来进行的。两种血管形成的方式都是一个动态、复杂的生理过程，通过调节因子和黏附物质调节细胞间的相互作用。移植物植入骨缺损部位后，早期同骨缺损自身修复一样存在血肿形成，纤维机化过程。后期在移植骨与骨断端间纤维组织中出现以下变化:[30]血管
芽→毛刷状血管→无血管软组织→串珠状血管→海绵状血管，而后相互间交通吻合形成毛细血管网，向植入物长入。
骨移植后的3个基本过程为移植骨的血管化、骨再生及骨端融合。其中血管化是关键环节，对整个修复过程起着决定作用。组织工程骨血管化主要有生长因子促组织工程骨血管化，种子细胞与其他细胞的共培养促血管化，组织瓣包裹组织工程骨促血管化，血管束植入促组织工程骨血管化，组织工程骨支架材料与血管化等。[31-34]有研究表明，骨支架的显微结构会对血管化的结果有非常重要的影响[35,36]，因此如何制备出适宜毛细血管生成的支架是需要重点研究的方向。
组织工程骨的血管再生是骨组织工程从基础研究向临床应用过渡的关键问题，随着骨组织工程学研究的深入发展及血管组织工程、基因转染、显微外科在骨组织工程学中的应用，相信血管化组织工程骨将有广阔的前景。[37]
2、实验内容
2.1 研究内容
产业化生产和进入临床应用是组织工程研究的最终目的，而临床上对骨组织、肝组织等具有复杂结构的组织工程血管化有着巨大的需求。显然，目前组织支架的设计和成形方法比较简单，偏向手工化，根本无法满足上述要求，带有血管网的组织支架还处在研究阶段。因此改进支架的制作技术，以实现组织支架的血管化制造有着重要意义。本研究将快速成形技术引入血管支架的制造中，配合计算机辅助设计，利用低温沉积制造(LDM)工艺制作适宜血管化的组织支架，并对所成形支架的表观特征、物理特性、生物相容性及血管化情况展开研究，探索LDM技术在组织支架制造中的潜力，从而推动产业化、个性化组织支架制造技术的发展。[38]
研究的主要内容包括:
(l)组织支架的显微结构设计研究以组织的解剖学和生理学为基础，结合血流动力学理论，并辅以计算流体力学分析，进行组织支架微观结构的设计以指导数字模型的CAD构建。
(2)组织支架的低温沉积制造研究利用三维设计软件SolidWorks分别绘制具有多层次孔道结构的组织支架的模型，然后通过快速成形数据处理软件Aurora进行分层处理得到数字模
型。以羟基磷灰石(HA)和聚乳酸（PLA）为原料，利用LDM工艺成形设计出的组织支架，根据实际成形情况修改数字模型，以确定出最适宜的模型构建方法及成形方式。
(3)低温沉积制造的成形参数研究研究成形参数对孔隙率、微孔结构和壁面粘接等支架表观特征的影响，分析其调控原理。
(4)支架的物理特性和生物相容性研究介绍支架的孔隙率、水渗透性和力学性能等支架的物理特性的表征方法，并分别进行评测;通过体内和体外实验研究支架的生物相容性和血管化性能，根据实验结果对支架参数进行改进。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议