常温下发芽七天绿豆芽不同部位的过氧化物酶的活性比较

常温下发芽七天的绿豆苗不同部位过氧化物酶的研究

广州大学生命科学学院 510006

摘要:从绿豆芽的下胚轴和胚芽中分别提取出过氧化物酶.比较了绿豆芽的胚芽和下胚轴的过氧化物酶活性.并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳,对胚芽与下胚轴的过氧化物同工酶进行了初步研究.两者果様化物酶同工酶的数量和活性有显著差异,绿豆芽胚芽有2条酶带,分别为Rf0.23和Rf0.49，绿豆芽下胚轴只有1条Rf0.23的谱带,并且胚芽过氧化物酶活性比下胚轴过氧化物酶高.

关键词: 过氧化物酶电泳同工酶活力测定

1 引言

过氧化物酶(Peroxidase,POD,供体:H2O2,氧化还原酶,EC 1、11、1、7)是一类广泛存在于各种植物,动物和微生物体内的氧化还原酶,催化过氧化氢和有机过氧化物对各种有机物和无机物的氧化作用.其分子量范围为35000~100000，以及正铁血红素Ⅸ为辅基糖蛋白.可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物,具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用.其理化性质稳

定,,不仅可以作为标记酶广泛应用于医学诊断、免疫细胞组织化学和酶免疫测定,而且在蛋白质、多肽、激素、病毒、神经轴突传递研究、视频卫生检测、海关检疫等多方面都有应用[1].同工酶作为基因的标志,在各种植物体内表现出明显的种类特异性和组织器官特异性[2].

本实验筛选从绿豆芽中提取、分离、纯化POD的条件,并对绿豆芽过氧化物酶部分理化性质进行研究,以验证前人所做实验所得出的结果,并出适合于分析同工酶的分析方法.

2 材料与方法

2.1 材料：常温下发芽时间为7天的绿豆苗

2.2 取样部位：下胚轴与胚芽

2.3 方法

2.3.1 提取植物中的过氧化物酶

①使用电子天平称取2.0g下胚轴、1.6g胚芽,剪碎.

②置入冰浴研钵中,加入少量石英砂,加入20mM KH2PO4 3mL,分别进行研磨.

③将研磨好的匀浆液进行离心4500rpm 15min

④离心过后,上清液即为POD提取液.将提取液定容到10ml,取5ml于零下20℃保存,作为电泳的POD样品.

2.3.2 考马斯亮蓝染法测定样品的蛋白质浓度

考马斯亮蓝G250具有红和蓝两种调.在酸性溶液中,其以游离态存在呈棕红;当它与蛋白质通过输水作用结合后变为蓝.它的灵敏度高,比氨基黑高3倍.反应速度快,约在2分钟左右时间达到平衡,在室温一小时内稳定.在0.01~1.0 mg蛋白质范围内,蛋白质浓度与A595nm成正比.通常用来测定蛋白质含量.通过测定595nm处吸光度的增加量可知与其结合蛋白质的量.

此反应重复性好,精确度高,线性关系好.标准曲线在蛋白质浓度稍大时稍有弯曲,这是由于燃料本身的两种颜形式光谱有重叠,试剂背景值随更多燃料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻,不影响测定.在试剂加入后的5-20min内,显最稳定.

①标准法制定标准曲线

取6支试管,按下表进行操作.

试管编号	0	1	2	3	4	5
0.1mg/ml标准蛋白溶液/ml	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1
0.15mol/L NaCl/ml	1	0.8	0.6	0.4	0.2	0
每管中蛋白质浓度μg/ml	0	20	40	60	80	100
考马斯亮蓝G250溶液/ml			5

透视望远镜

以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标,在电脑上绘制标准曲线.

②样品蛋白浓度的测定

取合适的未知样品体积,使其测定值在标准曲线的直线范围内.(若吸光度大于1,则用缓冲溶液进行整数倍稀释)根据所测定的A595nm值,在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量,从而计算出未知样品的蛋白质浓度.

取两支试管,按照下表添加试剂,以0号管为空白试样,1号管为未知蛋白质溶液试样,分别测量出下胚轴提取液、胚芽提取液的吸光度.

试管编号	0	1
待测液/ml	0	0.1
0.15 mol/L NaCl/ml	1	0.9
考马斯亮蓝试剂/ml	5
摇匀,1h内以0号管为空白对照,在595nm处比

2.3.3 愈创木酚氧化比法测定过氧化物酶活性

过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中.在有过氧化氢存在的情况下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐物质.生成物质的浓度与含量成正比,使用分光光度计可测量出生

成物的含量.

根据王琳[4]等的方法,稍加改进

①备好酶液,将分光光度计调到波长为470nm.

②取2只光径为1cm的比杯,愈一只中加入反应混合液2.0ml, KH2PO4 0.5ml,调零点.

③样品管中加入反应混合液2.0ml,下胚轴提取液0.5ml,立即计时.记下零秒时的读数,然后1分钟记录一次吸光度,共计3分钟.

④使用同样的方法测定胚芽提取液中的酶活性.

⑤以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小,用△A470/min·mg蛋白质（或鲜重g）表示.

酶活性(△A470/min·mg蛋白质)=每分钟OD变化值 / 蛋白(mg)或鲜重

2.3.4 植物过氧化物同工酶电泳

同工酶是指作用于底物相似或完全相同的酶的不同分子形式,即催化同一种反应而结构不

同的一族酶.它们是受遗传体系决定的酶的不同分子形式,利用凝胶电泳技术可以将它们分开,用专一的作用底物和特殊染料,把需要分析的酶染,在胶柱上呈现出同工酶谱.同工酶的不同分子形式,可以出现在同一生物的不同发育时期,选取不同部位的材料,酶带的情况就不一样.

①使用已提取好的下胚轴酶粗提取液与胚芽酶粗提取液,混入等体积的50%的蔗糖溶液,冰浴保存.

②安装电泳槽使用封口胶封底和两侧,每侧用2个长尾夹夹住,防止漏胶.

③配制聚丙烯酰胺凝胶系统

(1)A液:1mol/LHCL48.0ml,Tris36.6克,TEMED2ml,加水至100ml, pH 8.9.

(2)B液:丙烯酰胺56克；甲叉双丙烯酰胺1.47克加水至200毫升。

(3)C液:过硫酸铵（用前配制）2.8％，配100ml。

④配胶 A:B:C:水＝2.5 ml: 5ml: 1ml:11.5 ml,每块胶需胶液20ml。配胶后将胶液做好的夹层

玻璃板倾斜30°,并立即将胶液缓缓灌入夹层中，随后将玻板平放,再插入样品梳至梳齿3/4高度,等待20-30min凝胶凝固后,去胶带,清洗碎胶,轻轻拨出梳子.

自制锅盖天线

⑤安装将制的胶安装到电泳槽,凹面朝内,再用四个夹子固定,将缓冲液（需稀释10倍）加入到电极上下槽.

⑥将酶样品分别与含溴酚蓝的50%蔗糖溶液混匀,比例为1:1。

⑦加样和电泳

样品（1）：下胚轴酶粗蔗糖混合液20微升；

样品（2）：下胚轴酶粗蔗糖混合液20微升；

样品（3）：下胚轴酶粗蔗糖混合液20微升；

样品（4）：胚芽酶粗蔗糖混合液20微升；

样品（5）：胚芽酶粗蔗糖混合液20微升；

样品（6）：胚芽酶粗蔗糖混合液20微升；

上、下电泳槽加电极缓冲液后在恒压200V（每板电流约10mA）进行电泳，当溴酚蓝迁至离凝胶下端0.5—1厘米时停上电泳。电泳时间1.5—2小时。

用长针头注射器注水法自凝胶板上取出凝胶，凝胶要完整，不能断裂。

⑧染将完整的凝胶置于大号培养皿中,加入染液,浸泡整块凝胶,室温下染1—2分钟,呈现酶带后取出凝胶,用脱液分3次脱去背景颜,然后用水漂洗.

⑨带型清楚的胶应作摄影记录或作扫描测定.

3 实验结果

3.1 蛋白质浓度的测定

3.1.1 标准蛋白质溶液曲线

管号	0	1	2	3	4	5
蛋白质含量/μg	0	20	40	60	80	100
A595nm OD值	0	0.148	0.273	0.406	0.514	0.61

表 1标准曲线

3.1.2 测定下胚轴提取液与胚芽提取液蛋白质浓度

不同部位提取液的吸光值

样品	下胚轴提取液	胚芽提取液
A595nm OD值	0.399	1.049

下胚轴提取液的蛋白质浓度:Y(含量)=62.01μg/ml

胚芽提取液的蛋白质浓度:Y(含量)=167.74μg/ml

不同部位的蛋白质浓度

	下胚轴提取液	胚芽提取液
蛋白质浓度μg/ml	62.01	167.74

3.2 测定过氧化物酶活性

下胚轴提取液的酶活性测定

时间/t	0	30	60	90	120	150	180
A470nm OD值	0.086	0.099	0.119	0.141	0.163	0.186	0.208

胚芽提取液的酶活性测定

时间/t	0	30	60	90	120	150	180
A470nm OD值	0.345	0.426	0.51	0.573	0.665	0.735	0.798

下胚轴提取液的酶活性:

=1.312 △470/min mg

胚芽提取液的酶活性:

=1.808 △470/min mg

3.3 绿豆芽下胚轴与胚芽过氧化物酶同工酶电泳

同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳所得图谱

图 2凝胶电泳谱带

蜂盘图 3样品同工酶图谱

电泳样品酶带迁移距离记录

温湿度控制系统乳化柴油

胶柱样品	可见酶带数	由近至远记录酶带迁移距离/cm	溴酚蓝指示剂迁移距离/cm
1	1	2.2	9.7

2	1	2.2	9.8

3	1	2.3	9.7

4	广告推送2	2.1	9.8
		4.9
5	2	2.2	9.8
		4.9
6	2	2.2	9.8
		4.7

在绿豆芽下胚轴酶提取液中,只有一条酶带.

Rf==0.23

在绿豆芽胚芽酶提取液中,有两条酶带.

酶A : Rf==0.23

酶B : Rf==0.49

	绿豆芽下胚轴提取酶	绿豆芽胚芽提取酶A	绿豆芽胚芽提取酶B
Rf值	0.23	0.23	0.49

4 分析与讨论

4.1 绿豆芽胚芽与下胚轴过氧化物酶的活性

绿豆芽两个不同部位的酶活性如图所示,下胚轴中的过氧化物酶活性较低,胚芽中的过氧化物酶活性较高.

植物中含有大量的过氧化物酶,它与植物的呼吸作用、光和作用及生长素的氧化等许多新陈代谢反应有关.胚芽是植物胚的组成部分之一.在突破种子的皮后发育成叶和茎.因此胚芽中的代谢十分旺盛,因此过氧化物酶活性较高.下胚轴中的代谢强度稍弱.不同的组织由于功能不同,进行代谢的途径也有所不同,于是酶的活性也不尽相同.而同一组织由于发育时期不同,同一代谢过程的强度也有所不同[6].从得出胚芽过氧化物酶活性高于下胚轴过氧化物酶活性的结果,可以验证过氧化物酶活性与代谢密切相关.

4.2 绿豆芽上胚轴与胚芽过氧化物酶图谱分析比较