一种油茶果壳多糖提取方法及其应用

1.本发明属于天然活性成分提取和应用领域，具体涉及一种油茶果壳多糖提取方法及其应用。

背景技术：

2.油茶(camellia oleifera abel)属于山茶科、山茶属小乔木，为我国重点发展的第一大木本油料作物，在长江中下游地区拥有悠久的种植历史。油茶在加工榨油的过程中会产生大量副产物，油茶果壳作为主要的榨油剩余物之一，约占油茶果重量的60％左右，主要由木质素、纤维素、半纤维素、多糖、黄酮类、酚类和萜烯类组成。目前关于油茶果壳的高附加值开发利用并未多见。
3.免疫是机体抵御外界病原微生物和病原体入侵的一道重要屏障，巨噬细胞在免疫反应中发挥了重要作用。raw264.7细胞作为一种巨噬细胞，通常被用来作为免疫活性物质研究和开发的模式细胞。当前，涉及天然植物活性多糖提取及其调节机体免疫的研究报道很多，其中一些产品对人类健康和经济社会发展产生了重要影响。然而目前关于油茶果壳免疫活性物质的提取及应用研究鲜见报道。因此，对油茶果壳的免疫成分进行提取和开发应用对于提高产品附加值具有重要意义。

技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种油茶果壳多糖提取方法及其应用，以油茶果壳为原料，经闪式提取器粉碎、过筛、蒸馏水加热浸提、离心、减压浓缩、有机溶剂沉淀、活性炭脱和冷冻干燥等步骤制得了油茶果壳多糖，对所得油茶果壳多糖进行免疫活性测试，其可刺激raw264.7细胞免疫分子产生、增强免疫蛋白表达、促进tnfα释放和mrna表达，激活免疫相关信号通路，并且对细胞形态和存活率影响较弱。本发明制得的油茶果壳多糖得率和含量较高、工艺简单、成本低、免疫活性好。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种油茶果壳多糖提取方法，包括如下步骤：
6.(1)将油茶果壳充分干燥，经闪式提取器粉碎、过筛，再用蒸馏水加热浸提，离心保留上清液；
7.(2)将上清液采用旋转蒸发器进行减压浓缩，并用有机溶剂进行沉淀，离心保留沉淀物；
8.(3)将沉淀物用蒸馏水溶解，加入活性炭进行脱，离心保留上清液，将上清液抽滤并冷冻干燥，得出油茶果壳多糖。
9.进一步优选，干燥后的油茶果壳水分含量为15％-20％。
10.进一步优选，闪式提取器参数设置为4000-6000rpm/分钟，提取时间为1-3分钟。
11.进一步优选，过筛规格为80-100目。
12.进一步优选，油茶果壳粉末与蒸馏水的质量体积比为1:20-40，加热时间为8-12h。
13.进一步优选，旋转蒸发器参数设置为40-60bar，55-65℃，50-65rpm。
14.进一步优选，进行减压浓缩时，浓缩后溶液密度应达到1.1-1.3g/cm3。
15.进一步优选，有机溶剂选择甲醇、乙醇或丙酮中的一种。
16.进一步优选，浓缩液与有机溶剂的体积比为1：4-6。
17.进一步优选，进行机溶剂沉淀时，采用4℃保温，静置12-18h。
18.进一步优选，沉淀与蒸馏水的质量体积比为1：10-30。
19.进一步优选，活性炭与粗多糖的质量比为1：4-9。
20.进一步优选，进行活性炭脱时，采用恒温水浴加热，温度为50-60℃，时间为2-4h；
21.一种油茶果壳多糖的应用，所得油茶果壳多糖用于制备增强raw264.7细胞免疫反应的药物。
22.本发明具有如下有益效果：本发明以油茶果壳为原料，采用闪式提取器粉碎、过筛、蒸馏水加热浸提、减压浓缩、有机溶剂沉淀、活性炭脱以及冷冻干燥等步骤制得了油茶果壳多糖，通过raw264.7细胞模型进行免疫活性测试，其可刺激no和pge2产生、增强inos和cox2蛋白表达、促进tnfα释放和mrna表达、上调mapks信号蛋白erk、p38和jnk磷酸化水平，促进nf-κb核转位，并且对细胞形态和存活率影响较弱，有利于作为制备增强raw264.7细胞免疫反应药物上的应用。本发明制得的油茶果壳多糖得率和含量较高、制备工艺简单、成本低、免疫活性好。
附图说明
23.图1本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响细胞形态的数据图谱；
24.图2本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响细胞存活率的数据图谱；
25.图3本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响no产生的数据图谱；
26.图4本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响pge2产生的数据图谱；
27.图5本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响inos蛋白表达的数据图谱；
28.图6本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响cox2蛋白表达的数据图谱；
29.图7本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响tnfα释放的数据图谱；
30.图8本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响il-6释放的数据图谱；
31.图9本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响il-1β释放的数据图谱；
32.图10本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响inos基因表达的数据图谱；
33.图11本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响cox2基因表达的数据图谱；
34.图12本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响tnfα基因表达的数据图谱；
35.图13本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响il-1β基因表达的数据图谱；
36.图14本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响il-6基因表达的数据图谱；
37.图15本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响gapdh基因表达的数据图谱；
38.图16本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响mapks信号通路蛋白erk、p38和jnk磷酸化水平的数据图谱；
39.图17本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响mapks信号通路蛋白erk磷酸化水平的量化数据图谱；
40.图18本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响mapks信号通路蛋白p38磷酸化水平的量化数据图谱；
41.图19本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响mapks信号通路蛋白jnk磷酸化水平的量化数据图谱；
42.图20本发明实施例1中油茶果壳多糖(cps)影响nf-κb核转位的数据图谱。
具体实施方式
43.下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明，所述的是对本发明的解释而不是限定。
44.实施例1
45.将油茶果壳进行充分干燥、使其水分含量达到20％左右，称取油茶果壳1kg放入闪式提取器进行粉碎、过100目筛，并加入20倍体积蒸馏水、加热至80℃、浸提8h，离心(4000rpm，10min)保留上清液；用旋转蒸发器将上清液减压浓缩，参数设置为60bar、55℃、50rpm，使浓缩液体积约为500ml，密度为1.1g/cm3，用4倍体积甲醇对浓缩液进行沉淀，搅拌均匀，4℃静置12h，离心得沉淀物；将沉淀物用10倍体积蒸馏水溶解，加入10％活性炭，水浴加热至50℃，维持2h，离心并将上清液进行抽滤，滤液用旋转蒸发器进行减压浓缩并冷冻干燥，采用苯酚-硫酸法检测所得油茶果壳多糖的总糖含量为37.1％，得率为25.34％，保存备用。
46.准确称取油茶果壳多糖100mg，加入10ml蒸馏水充分溶解，紫外灭菌30min，4℃保存备用；按照倍比稀释方式，用无血清dmem高糖培养液将油茶果壳多糖母液稀释成400、200、100、50、25、12.5μg/ml，现配现用；培养raw264.7细胞至对数生长期，将细胞接种于96孔板中过夜，密度为5x10^4/孔，体积为100μl/孔；将配好的油茶果壳多糖和lps(2μg/ml)处理细胞24h，100μl/孔；通过显微镜拍照显示细胞形态，mtt法检测细胞存活率，通过griess法检测细胞上清液中no产生；结果表明油茶果壳多糖对细胞形态改变和存活率影响较弱(参照图1和图2)，并且可以刺激raw264.7细胞no产生(参照图3)。
47.培养raw264.7细胞至对数生长期并接种于6孔板中过夜，密度为1x10^6/孔，体积为3ml/孔；用油茶果壳多糖和lps处理细胞24h，通过western blotting检测inos和cox2蛋白表达，通过elisa检测细胞上清液中pge2、tnfα、il-6和il-1β含量，通过rt-pcr检测inos、cox2、tnfα、il-6和il-1βmrna水平；结果显示油茶果壳多糖可以促进raw264.7细胞pge2产生(图4)，增强inos和cox2蛋白表达(图5和图6)，并且促进tnfα释放(图7至图9)和mrna表达(图10至图15)。
48.培养raw264.7细胞至对数生长期并接种于60mm小皿中过夜，密度为1.5x10^6/孔，体积为4ml/皿；用油茶果壳多糖和lps处理细胞1、2、6h，通过western blotting检测erk、p38和jnk蛋白表达以及磷酸化水平；结果显示油茶果壳多糖可以上调raw264.7细胞erk、p38和jnk蛋白磷酸化水平(图16至19)。
49.培养raw264.7细胞至对数生长期并接种于6孔板中过夜，密度为1x10^5/孔，体积为3ml/孔；用油茶果壳多糖和lps处理细胞6h，通过免疫荧光技术分析nf-κb核转位情况；结果显示油茶果壳多糖可以促进raw264.7细胞nf-κb核转位(图20)。
50.实施例2
51.将油茶果壳进行充分干燥、使其水分含量达到18％左右，称取油茶果壳1kg放入闪式提取器进行粉碎、过100目筛，并加入25倍体积蒸馏水、加热至80℃、浸提10h，离心(4000rpm，10min)保留上清液；用旋转蒸发器将上清液减压浓缩，参数设置为50bar、60℃、50rpm，使浓缩液体积约为500ml，密度为1.2g/cm3，用5倍体积丙酮对浓缩液进行沉淀，搅拌均匀，4℃静置14h，离心得沉淀物；将沉淀物用20倍体积蒸馏水溶解，加入15％活性炭，水浴加热至55℃，维持3h，离心并将上清液进行抽滤，滤液用旋转蒸发器进行减压浓缩并冷冻干燥，采用苯酚-硫酸法检测所得油茶果壳多糖的总糖含量为38.5％，得率为26.17％，保存备用。
52.准确称取油茶果壳多糖100mg，加入10ml蒸馏水充分溶解，紫外灭菌30min，4℃保存备用；按照倍比稀释方式，用无血清dmem高糖培养液将油茶果壳多糖母液稀释成400、200、100、50、25、12.5μg/ml，现配现用；培养raw264.7细胞至对数生长期，将细胞接种于96孔板中过夜，密度为8x10^4/孔，体积为100μl/孔；将配好的油茶果壳多糖和lps(2μg/ml)处理细胞24h，100μl/孔；通过显微镜拍照显示细胞形态，mtt法检测细胞存活率，通过griess法检测细胞上清液中no产生；结果表明油茶果壳多糖对细胞形态和存活率影响较弱，并且可以刺激raw264.7细胞no产生。
53.培养raw264.7细胞至对数生长期并接种于6孔板中过夜，密度为1.5x10^6/孔，体积为3ml/孔；用油茶果壳多糖和lps处理细胞24h，通过western blotting检测inos和cox2蛋白表达，通过elisa检测细胞上清液中pge2、tnfα、il-6和il-1β含量，通过rt-pcr检测inos、cox2、tnfα、il-6和il-1βmrna水平；结果显示油茶果壳多糖可以促进raw264.7细胞pge2产生，增强inos和cox2蛋白表达，并且促进tnfα释放和mrna表达。
54.培养raw264.7细胞至对数生长期并接种于60mm小皿中过夜，密度为1x10^6/孔，体积为4ml/皿；用油茶果壳多糖和lps处理细胞1、2、6h，通过western blotting检测erk、p38和jnk蛋白表达以及磷酸化水平；结果显示油茶果壳多糖可以上调raw264.7细胞erk、p38和jnk蛋白磷酸化水平。
55.培养raw264.7细胞至对数生长期并接种于6孔板中过夜，密度为1.5x10^5/孔，体积为3ml/孔；用油茶果壳多糖和lps处理细胞6h，通过免疫荧光技术分析nf-κb核转位情况；结果显示油茶果壳多糖可以促进raw264.7细胞nf-κb核转位。
56.实施例3
57.将油茶果壳进行充分干燥、使其水分含量达到15％左右，称取油茶果壳1kg放入闪式提取器进行粉碎、过100目筛，并加入30倍体积蒸馏水、加热至85℃、浸提12h，离心(4000rpm，10min)保留上清液；用旋转蒸发器将上清液减压浓缩，参数设置为40bar、60℃、55rpm，使浓缩液体积约为500ml，密度为1.3g/cm3用6倍体积乙醇对浓缩液进行沉淀，搅拌均匀，4℃静置15h，离心得沉淀物；将沉淀物用30倍体积蒸馏水溶解，加入20％活性炭，水浴加热至60℃，维持4h，离心并将上清液进行抽滤，滤液用旋转蒸发器进行减压浓缩并冷冻干燥，采用苯酚-硫酸法检测所得油茶果壳多糖的总糖含量为39.2％，得率为27.83％，保存备用。
58.准确称取油茶果壳多糖100mg，加入10ml蒸馏水充分溶解，紫外灭菌30min，4℃保存备用；按照倍比稀释方式，用无血清dmem高糖培养液将油茶果壳多糖母液稀释成400、200、100、50、25、12.5μg/ml，现配现用；培养raw264.7细胞至对数生长期，将细胞接种于96
孔板中过夜，密度为1x10^5/孔，体积为100μl/孔；将配好的油茶果壳多糖和lps(2μg/ml)处理细胞24h，100μl/孔；通过显微镜拍照显示细胞形态，mtt法检测细胞存活率，通过griess法检测细胞上清液中no产生；结果表明油茶果壳多糖对细胞形态和存活率影响较弱，并且可以刺激raw264.7细胞no产生。
59.培养raw264.7细胞至对数生长期并接种于6孔板中过夜，密度为1x10^6/孔，体积为3ml/孔；用油茶果壳多糖和lps处理细胞24h，通过western blotting检测inos和cox2蛋白表达，通过elisa检测细胞上清液中pge2、tnfα、il-6和il-1β含量，通过rt-pcr检测inos、cox2、tnfα、il-6和il-1βmrna水平；结果显示油茶果壳多糖可以促进raw264.7细胞pge2产生，增强inos和cox2蛋白表达，并且促进tnfα释放和mrna表达。
60.培养raw264.7细胞至对数生长期并接种于60mm小皿中过夜，密度为1.5x10^6/孔，体积为4ml/皿；用油茶果壳多糖和lps处理细胞1、2、6h，通过western blotting检测erk、p38和jnk蛋白表达以及磷酸化水平；结果显示油茶果壳多糖可以上调raw264.7细胞erk、p38和jnk蛋白磷酸化水平。
61.培养raw264.7细胞至对数生长期并接种于6孔板中过夜，密度为1x10^5/孔，体积为3ml/孔；用油茶果壳多糖和lps处理细胞6h，通过免疫荧光技术分析nf-κb核转位情况；结果显示油茶果壳多糖可以促进raw264.7细胞nf-κb核转位。
62.本实施例中的茶果壳多糖具备刺激no和pge2产生、增强inos和cox2蛋白表达、促进tnfα释放和mrna表达、上调mapks信号蛋白erk、p38和jnk磷酸化水平，促进nf-κb核转位，并且对细胞形态和存活率影响较弱，有利于作为制备增强raw264.7细胞免疫反应药物上的应用。
63.对比例
64.将油茶果壳进行充分干燥、使其水分含量达到20％左右，称取油茶果壳1kg进行粉碎、过100目筛，并加入20倍体积蒸馏水、加热至80℃、浸提8h，离心(4000rpm，10min)保留上清液；用旋转蒸发器将上清液减压浓缩，参数设置为60bar、55℃、50rpm，使浓缩液体积约为500ml，用1倍体积乙醇对浓缩液进行沉淀，搅拌均匀，4℃静置12h，离心得沉淀物；将沉淀物用10倍体积蒸馏水溶解，加入25％活性炭，水浴加热至50℃，维持2h，离心并将上清液进行抽滤，滤液用旋转蒸发器进行减压浓缩并冷冻干燥，采用苯酚-硫酸法检测所得油茶果壳多糖的总糖含量为27.9％，得率为16.34％。本发明采用闪式提取器进行粉碎，进行有机溶剂沉淀时，浓缩液与有机溶剂的比值进行了调整，相较于未采用闪式提取器，并且浓缩液与有机溶剂的比值为1:1的方式，获得了更好的提取效果，极大的提升了油茶果壳多糖的得率。
65.以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

技术特征：

1.一种油茶果壳多糖提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将油茶果壳充分干燥，经闪式提取器粉碎、过筛，再用蒸馏水加热浸提，离心保留上清液；(2)将上清液采用旋转蒸发器进行减压浓缩，并用有机溶剂进行沉淀，离心保留沉淀物；(3)将沉淀物用蒸馏水溶解，加入活性炭进行脱，离心保留上清液，将上清液抽滤并冷冻干燥，得出油茶果壳多糖。2.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法，其特征在于，步骤(1)中，干燥后油茶果壳的水分含量为15％-20％。3.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法，其特征在于，步骤(1)中，闪式提取器参数为4000-6000rpm/分钟，提取时间为1-3分钟，过80-100目筛。4.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法，其特征在于，步骤(1)中，油茶果壳粉末与蒸馏水的质量体积比为1:20-40，加热时间为8-12h。5.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法，其特征在于，步骤(2)中，旋转蒸发器参数设置为40-60bar，55-65℃，50-65rpm。6.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法，其特征在于，步骤(2)中，进行减压浓缩后，浓缩液密度应达到1.1-1.3g/cm3。7.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法，其特征在于，步骤(2)中，有机溶剂选择甲醇、乙醇或丙酮中的一种，浓缩液与有机溶剂的体积比为1：4-6，进行有机溶剂沉淀时，采用4℃保温，静置12-18h。8.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法，其特征在于，步骤(3)中，沉淀与蒸馏水的质量体积比为1：10-30；活性炭与沉淀物的质量比为1：4-9。9.根据权利要求1所述的一种油茶果壳多糖提取方法，其特征在于，步骤(3)中，进行活性炭脱时，采用恒温水浴加热，温度为50-60℃，时间为2-4h。10.一种权利要求1-9任意一项所提取的油茶果壳多糖的应用，其特征在于，所得油茶果壳多糖用于制备增强raw264.7细胞免疫反应的药物。

技术总结

本发明提供一种油茶果壳多糖提取方法，将油茶果壳进行充分干燥，经闪式提取器进行粉碎、过筛得出油茶果壳粉末，用蒸馏水对油茶果壳粉末进行加热浸提，离心保留上清液；将上清液采用旋转蒸发器进行减压浓缩，并用有机溶剂进行沉淀，离心保留沉淀物，将沉淀物用蒸馏水溶解，并用活性炭进行脱，离心、将上清液抽滤并冷冻干燥，得油茶果壳多糖。本发明制得的油茶果壳多糖得率和含量较高、制备工艺简单，成本低、免疫活性好。免疫活性好。免疫活性好。