网络出版时间：2021-2-513：03网络出版地址：ht R s：//Rkcms/demd/34.1065.R.20210205.1052.031.html ◊综述！
微环境下Wnt/p-catenin通路参与牙周膜干细胞 沈振国，赵荣权，欧琳琳，周柠综述邢田审校
摘要牙周膜干细胞作为牙周组织中的干细胞，具有分化成骨的能力，在牙槽骨修复过程中具有巨大的潜力。WnRC-catenin通路在身体发育中起重要作用。目前，已发现多种微环境可通过WnRC-cdenin通路调节牙周膜干细胞的成骨分化。该文综述Wnt/C-catenin通路在不同微环境中调控牙周膜干细胞成骨分化的过程，为牙周疾病的基础研究和临床防 治提供参考。 关键词牙周膜干细胞;WnRC-catenin通路；成骨分化
中图分类号R78
文献标志码A文章编号1000-1492(2021)03-0497-04 doi：10.19405//cnki.issnlOOO-1492.2021.03.033
牙周膜干细胞(pe/odontal/yament stem cells, PDLSCs)以其多向分化的能力以及易于获取的组织来源优势，成为非常理想的组织工程种子细胞，在牙周再生领域中得到广泛的应用。然而，/DLSCs成骨分化能力受到多种因素的调控，其分化机制也是近年来的研究热点,WnR-cdenin作为调节细胞生长和分化的重要信号途径，在PDLSCs的分化中发挥重要的作用。
1牙周膜干细胞的生物学特性
Sea el aP1〕于2004年成功从离体牙牙周组织中分离培养出PDLSCs，发现其具有较强的克隆形成能力，及成牙骨质、成神经、成脂等多项分化能力，且高表达间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)表面标志物STRO-1和CD146/MUC18，可成为最具牙 2020-07-20接收
基金项目：安徽省自然科学基金(编号：1908085MH256)；病原生物学安徽省重点实验室开放课题(编号:BYT01)；安徽医科
大学博士科研资助基金(编号:XJ201708)；国家级大学生
创新创业训练计划(编号:201810366041)
作者单位：安徽医科大学口腔医学院、安徽医科大学附属口腔医院、安徽省口腔疾病研究重点实验室，[肥200002
作者简介：沈振国，男，本科生；
邢田，女，讲师，责任作者，E-mail:xingtian8110@163-
com 周组织修复潜力的干细胞之一。自Lindoos el ai[2]揭示PDLSCs成骨分化具有临床应用价值后，围绕这方面的研究取得较大进展。体外实验采用含地塞米松、—磷酸甘油和抗坏血酸的成骨诱导液培养PDLSCs，发现成骨相关基因表达升高，如碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、特异性Runt相关性转录因子(Runt-related transc/ption factor,Runx)2、骨形态发生蛋白(bona morphogenetic p-tein,BMP) 2、胶原蛋白(collagen,Col)I、骨钙素(osteocydin, OCN)，细胞体外长期培养能够形成钙化结节。
PDLSCs迁移和增殖对修复缺损具有重要作用，而其迁移和增殖受细胞周围环境、代谢产物、神经递质、细胞因子等的影响。基质细胞衍生因子(stomal cell de/ved factor,SDF)1甲状旁腺激素(parathyroid hooona, PTH)、和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)2等细胞因子能够促进PDLSCs 的增殖和迁移〔i4〕。
2Wnt/p-catenin通路
1982年Nussar w L(5)在小鼠乳腺癌中发现了Integration-1(INT-1)基因。之后的研究表明，果蝇中的的无翅基因与INT-1基因功能类似，属于同源基因，因此将二者并称为Wnt基因，此基因调控的信号传导系统为Wnt通路⑷。此通路对细胞的生长、分化以及募集等多种生物学过程发挥重要作用⑴，且与肿瘤、炎性疾病和心血管疾病等密切相关。
Wnt通路由4部分组成:①细胞外的配体蛋白Wnt蛋白，由Wnt家族基因转录表达而来;②细胞膜上的卷曲蛋白受体(frizzled，/zd)及低密度脂蛋白受体相关蛋白(dw-dens/y/pop-tein receptor-related potRn,LRP)5/6；③细胞浆中的信号转导部分;④细胞核内的转录调控部分。
Wnt/0-catenin通路，即经典Wnt通路：胞膜外配体Wnts蛋白与受体结合后，开启通路的传导并活化胞内的蓬乱蛋白(dishevelled,Dsh/Dvi)从而降低
由腺瘤性结肠息肉病蛋白#adenomatous polyosis ca-li,APC)、糖原合成酶激酶-30(glycogen synthase ki-nase-30,GSK-30)、Axin、0-连环蛋白(0-catenin)等形成的降解复合体中关键成分GSKA0的活性，进而阻止0-catenin降解，使0-catenin积聚并转移入核与胞核内的转录因子T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/CEFs)结合，激活下游靶基因，引发生物学效应。
3局部微环境调控Wnt通路影响PDLSCs成骨分化
3.1炎症微环境WnW-cateniv通路在炎症微环境中对PDLSCs的成骨起着重要的作用。慢性牙周炎患者炎症牙龈和龈沟液中高表达白细胞介素(inc teLeukin,IL)A3，体外实验中牙龈吓K单胞菌可活化牙龈上皮细胞高表达IL-33⑷°ILA3可促进增殖和克隆形成率，但是抑制ALP的活性和矿化结节的产生，给予PNU(-catenin抑制剂)的处理，可以恢复这种抑制效应，表明IL-33通过Wnt/0-catenin通路调控PDLSCs的成骨分化潜力［9］°
低浓度(,1*g/ml)脂多糖(LipopolysgcchgI Lbe，LPS)是否抑制PDLSCs成骨分化尚存争议°Xing el al［10］使用低浓度(0.5*g/ml)大肠杆菌LPS 活化PDLSCs，发现Wnt/0-catenin通路蛋白Cycliv 和激活转录共刺激因子(transcriptional activator with a PDZ moBf,TAZ)表达增高，成骨关键基因Runx2、ALP%Cot-I表达增高，茜素红染显示钙化结节增多。降低TAZ同时可以降低LPS诱导的成骨增强作用。此外，阻断Wnt/-catenin通路可以抑制LPS 引起的成骨分化。然而，文献(11〕报道，高浓度LPS ('10*g/ml)可显著抑制PDLSCs增殖和成骨分化，同时促进炎性因子表达，加重牙周组织的损伤°可见,LPS通过Wnt/0-catenin通路调控干细胞成骨分化作用依赖LPS浓度。
Peng el al［12］体外分离培养患者的PDLSCs，发现源自牙周炎患者炎症组织的细胞较正常受试者，其成骨分化能力明显降低。长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)可能参与Wnt信号通路的调控来调节干细胞成骨分化能力。在PDLSCs成骨分化过程中,ALP、Runx2和成骨相关转录因子抗体(oste/x,OSX)的表达增加，而lncRNA连NCR的表达减少。lncRNA连NCR可能通过抑制micmRNA (mi
R)A58，进一■步激活Notch2/Wnt/0-catenin通路，从而抑制PDLSCs成骨分化。
Wang el al［13］分离培养牙周炎患者炎症局部PDLSCs，高通量测序发现，与正常组相比，lncRNA-POIR显著降低°lncRNA连0IR作为显著的促进成骨的基因，可能作为miR-182的竞争性内源性RNA，调控其靶基因Fox01表达，继而,Fox01通过与TCF-4竞争0-catenin，抑制经典Wnt通路，增加其成骨分化。然而,Wnt通路参与调控成骨可能与其他信号通路存在串联关系，如NF-B°炎症通过NF--B通路增加miR-182的表达，同时miR-182在炎症微环境中的过表达导致了lncRNA连OIR/miR-182调节网络的失衡°
3.2高糖微环境体外试验中，当暴露于高糖环境时,PDLSCs产生细胞内活性氧(reactive oxyyen spv cies,ROS)，成骨能力降低°清除ROS可激活PI3IK Akt进而促使0-catenin入核结合TCF/CEF，阻断高糖介导的PDLSCs成骨抑制［14］°这表明高糖环境使PDLSCs内产生氧化损伤，通过抑制PI3K/Akt/Wnt/ 0-catenin通路抑制其成骨分化。
糖尿病大鼠牙周膜组织DNA甲基化水平升高，牙槽骨骨量和密度降低。体外实验，高糖处理PDLSCs可降低0-catenin、p-GSK-30和LEF1表达。DNA甲基转移酶抑制剂5-Aze-2-脱氧胞!(5-Aze-DC)，可降低PDLSCs DNA甲基化水平，并挽救了PDLSC，高下的化°然,
采用Wnt通路的拮抗剂Dickkopf相关蛋白(Dickko-pf-related protein,DKK)-1，可以阻断5-Aze-DC在高
糖中对细胞成骨分化的保护作用。这一研究［15］首次提出，在高糖环境下，抑制DNA甲基化可通过Wnt信号通路促进PDLSCs的成骨分化。以上研究表明，尿导的PDLSC，化
能是通过DNA甲基化抑制Wnt/0-catenin通路造成的°
然而，体外将PDLSCs进行成骨诱导，用晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGE,),，表ALP 活性降低，矿化结节形成减少，成骨特异性基因Runx2、OSX、ALP、OPN、Cot-I和OCN表达下调°经典Wnt/0-catenin通路抑制剂XAV-939部分挽救了AGE诱导的PDLSCs成骨潜能的抑制。可见AGE s激活了经典Wnt/0-catenin通路，促进了—cateniv的核转位，从而减弱了PDLSCs的成骨分化能力［16］°
3.3生物应力用循环液压模拟生理性的咀嚼，压
激下牙PDLSC抑制°液压下，乳牙PDLSCs中+7烟碱型乙酰胆碱受体(at-
pha7nicotinic acetylcholine receptors,+7nah-被激活，GSKT-去磷酸化，激活WnRC-cyten/i通路，核因子k B受体活化因子配体#receptor activator of NK-k B Pyand,RANKL)上调、Runx2%ALP和骨保护素(osteopotege/n,OPG)的降低，PDLSCs表现出诱导破骨细胞分化的能力。抑制+7nachr或WnR—catenin通路可逆转成骨抑制[17]。
然而，/DLSCs在液压压力模拟的正畸力的作用下成骨分化，且短期作用(1h)较长期作用(12h)的成骨效应较强。在力的作用下,PDLSCs中的GSK-30磷酸化，活化0-catenin入核，激活Wnt/C-catenin 通路，促进PDLSCs成骨分化[18]o这可能与PDLSCs 不同年龄来源(乳牙和恒牙)相关。可见在PDLSCs 分化的不同阶段，生物应力作用下的Wnt/C-catenin 通路起到正向或负向的调控作用，以满足机体发育的不同阶段的需求。
3.4药物阿奇霉素(azithromycin，AZM)结合非手术牙周疗法可缓解临床症状[19]，同时抑制破骨细胞分化和骨吸收[20]o体外试验中，肿瘤坏死因子(tumoeneceo,i eactoe，TNF)-+化PDLSC,
ALP活性降低，钙化结节减少。AZM的加入使得降低PDLSCs成骨分化能力得到回升。同时p-cata-nin、磷酸化p65和磷酸化I k B-t蛋白表达下降。这表明，AZM通过同时抑制WnR-catenin和NF-cB 通路，促进PDLSCs在炎症微环境中的成骨分化[21]°积雪草！(asiaticosida，AC)可促进伤口愈合，具有抗炎、抗氧化和抗溃疡的活性[22]°体外实验中，AC可促进PDLSCs成骨分化，能够显著上调PDLSCs中Wnt3a基因的表达，并呈剂量依赖性(最适浓度100*mol/L)，同时抑制Wnt的负调节因子Axin2，激活WnRp-catenin通路，进而诱导OSX和牙本质基质蛋白(dentin mateo protein，DMP)1表达，促进PDLSCs成骨分化(叫
作为胰高血糖素样肽氨类似物，肠促胰岛素类似物#exendin-4，Ex-4)在细胞和分子水平上都具有快速
可控硅触发电路
的抗炎作用，对MSCs成骨分化有积极的影响[24-25]°ExT同样增强PDLSCs的成骨分化能力，Ex-4处理使细胞核与细胞浆的p-catenin蛋白表达均上调，GSKT0磷酸化增加,Wnt/p-catenin通路激活，同时促进I'B+磷酸化来抑制NF-cB通路的活化。Ex-4亦可以通过相同机制减轻高浓度LPS (10*g/mi)对PDLSCs的成骨分化抑制作用[26]°吸烟已被公认为牙周炎的独立危险因素之一，烟草的有效成分尼古丁可以抑制胶原合成%破坏上皮结构，引起牙周局部组织损伤[27]°尼古丁对PDLSCs的成骨分化的抑制作用具有剂量依赖性。尼古丁处理可激活+7nachr从而激活WnRp-cata-nin通路，抑制PDLSCs成骨。分别抑制+7nachr和Wnt/p-catenin通路可挽回受抑制的PDLSCs成骨分化叫
3.5生物支架近年来随着种植技术临床应用增多，研究者多聚焦于传统材料的改良和新型材料的研发。体外实验中，将PDLSCs培养于聚苯乙烯(TCPS)上，和四种没有骨诱导因子的钛盘[光滑的抛光处理(PT)、亲水性抛光处理(pmodPT)、粗糙喷砂-大颗粒-酸蚀(sandblasted,larye-g/l,acid-etched,SLA)和亲水性(mod)SLA]，然后检测成骨活性。与TCPS和其他钛表面相比较，培养在SLA上的细胞出现较高的成骨活性。SLA和modSLA上培养的细胞高表达Wnt3a和p-catenin，但在PT和pmodPT上细胞却高表达钙依赖性Wnt信号分子Wnt5a、钙调素；此外，不同的表面修饰也会改变细合+2/p1、,onichedgehog Notch号子的表达。总之，表面粗糙度和亲水性可以影响不同的Wnt通路和信号分子参与调控PDLSCs的成骨分化[29]°
Max w030]以+-磷酸三钙颗粒为前驱体，在水溶液中通过水热反应制备了具有微纳米杂化表面的'基磷
灰石#HA)生物陶瓷(mnHA)，与具有平坦致密表面的HA生物陶瓷相比,mnHA生物陶瓷能够促进细胞黏附、增殖、ALP活性以及成骨/成牙骨质基因的表达。此外,mnHA生物陶瓷还能引起经典Wnt信号通路中LRP5和p-catenin的表达上调。DKK-1可抑制ALP活性和ALP、OCN、CAP、CEMP 和Runx2基因的表达。可见，能够成为牙周组织再生的mnHA通Wnt通/牙质。
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