一种基于球蛋白1S的纳米运载体系、制备方法及应用

一种基于球蛋白1s的纳米运载体系、制备方法及应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于球蛋白1s的纳米运载体系、制备方法及应用。

背景技术：

2.纳米颗粒尺寸大概在几百纳米左右，较小的粒径决定了它们独特的理化特性，使其在各种生物应用中特别突出，并且纳米材料表现出高表面积-体积比，通过对其表面进行功能性修饰以及接枝配体等可以改变他们在体内的作用。纳米载体不仅能够提高药物的靶向性并且实现可控的释放，还有助于改善药物的体内循环时间和溶解度、细胞内递送以及穿透生物膜。纳米运载体系是由蛋白、多糖、有机溶剂、表面活性剂等以适当比例自发形成的半透明或者不透明的悬浮稳定体系，可作为维生素、功能性油脂、益生菌和多酚类化合物等营养功效因子的稳态递送体系，广泛应用于食品、医药等领域。研究表明，不管是极性的营养素、活性因子和药物，还是非极性的营养素、活性因子和药物，合适的纳米运载体系均可提高其稳定性和作用时间，以及加工应用范围。
3.近年来，食品、医药等生物技术领域中对生物相容性蛋白质基于纳米颗粒的需求不断增加，并且有望使用这些纳米载体进行更多的研究。由于动物组织中含有传染性病原体的污染风险以及个人偏好等特点，从植物中提取的蛋白质已被广泛用作药物输送载体，并被用作动物蛋白质的替代品。基于食物的蛋白质不仅具有生物可降解性和生物相容性，而且价格相对低廉、可再生且易于加工，颗粒副产物的积累减少，宿主免疫反应最小化，使其在药物输送方面更具吸引力，对人类健康更有价值。
4.除安全性外，还应考虑临床应用。显然，体内和生物分析对于得出有关安全性、剂量、药理活性和这些纳米系统命运的正确结论是非常必要的。然而，这些结果表明，基于食品蛋白质的纳米载体是疏水性和难溶性分子药物递送的合适工具。在食品蛋白中，球蛋白1s(globulin-1 s allele，gsa)是一种糖基化小麦致敏蛋白。不溶性物质包括对人类健康至关重要的酚类化合物、维生素和精油等等以及用于食品和制药行业的产品，如香精、香料和食品着剂。姜黄素(curcumin，cur)是从姜黄根茎中提取的生物活性多酚化合物，目前是世界上销量最大的天然食用素之一。姜黄素除具有多种药理活性(例如抗氧化、抗菌、抗炎和抗癌等活性)外，还在世界范围内被广泛用作香料(例如咖喱)、调味剂等。但姜黄素的水溶性极低，而且稳定性差，易氧化，易受到光照降解，这极大地限制了它的临床效果与实际应用。
5.目前，基于球蛋白1s的纳米运载体系，运载不溶性化合物还未见报道。

技术实现要素：

6.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
7.本发明用一种新型的食品级绿化学方法即球蛋白1s与不溶性物质(如姜黄素)结合，达到运输不溶性物质或难溶性物质的目的。
8.本发明的一个目的在于提供一种用于运输不溶性化合物的纳米运载体系包装试剂盒，为生物、医药等领域相关研究与应用提供一种新的工具以及新的技术方法。
9.本发明提供了一种基于球蛋白1s的纳米运载体系，所述纳米运载体系包括载体和疏水性植物多酚类物质，所述载体为球蛋白1s，所述疏水性植物多酚类物质为姜黄素或橙皮素。
10.球蛋白1s(globulin-1 s allele，gsa)，又称为小麦gsa蛋白。
11.小麦gsa蛋白具有良好的生物相容性，易于制备微颗粒或纳米颗粒，可作疏水物或功能活性成分的理想载体。
12.本发明还提供了所述基于球蛋白1s的纳米运载体系的制备方法，包括以下步骤：
13.(1)将球蛋白1s溶解nacl溶液中，磁力搅拌至完全溶解，得到混合溶液；
14.(2)自组装：将步骤(1)中混合溶液离心，取上清液分散到分散液中进行自组装，即得球蛋白1s分散液；
15.(3)向(2)中球蛋白1s分散液加入疏水性植物多酚类物质，充分混合后离心，去上清液后即得基于球蛋白1s的纳米运载体系；
16.其中所述疏水性植物多酚类物质为姜黄素或橙皮素。
17.优选的，步骤(3)中加入的疏水性植物多酚类物质与球蛋白1s的浓度比范围为1～10∶1。
18.优选的，步骤(2)中分散的方法为：将离心后的上清液逐滴分散到分散液中。步骤(2)中上清液与分散液的体积比为2～5∶1。步骤(2)中所述分散液的ph值为6.5～7.5。
19.优选的，步骤(1)中nacl溶液的质量分数为5％～15％。
20.更为优选的，步骤(1)中nacl溶液的质量分数为10％。
21.本发明还提供了所述的基于球蛋白1s的纳米运载体系在功能性食品或药物中的应用。
22.本发明的有益效果：
23.本发明所述的基于球蛋白1s的纳米运载体系通过小麦gsa蛋白作为输送系统，比如，包埋姜黄素将其制成颗粒，目的为增加姜黄素的稳定性，以延长其释放时间，提高姜黄素及其产品在食品和药品中的应用价值，同时为小麦gsa蛋白的高值化利用提供理论和应用参考。
附图说明
24.图1是在一定温度和浓度的gsa在不同姜黄素浓度下的荧光发射光谱图。
25.图2是姜黄素在不同浓度和温度下淬灭小麦gsa蛋白的stem-volmer图。
26.图3是小麦gsa蛋白和姜黄素之间荧光淬灭的lineweaver-burk图。
27.图4是姜黄素与小麦gsa蛋白-姜黄素复合物光照稳定性结果分析图。
28.图5是小麦gsa蛋白-姜黄素复合物对dc细胞相关基因mrna的相对表达量结果分析图。
具体实施方式
29.实施例1
30.小麦gsa蛋白的提取与纯化。
31.从中国春小麦中提取gsa蛋白。面粉经过丙酮脱脂后溶于磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)，0.45μm滤膜过滤后，利用hitrap cona 4b层析柱通过pure25蛋白纯化仪分离，收集洗脱峰，超滤浓缩并置换溶液为pbs，即为纯化的小麦gsa蛋白。
32.分离使用平衡缓冲液：20mmol/l tris-hcl、0.3mol/l nacl、2mmol/l mncl2和2mmol/l cacl2，ph为7.4；
33.洗脱缓冲液：20mmol/l tris-hcl、0.3mol/l nacl、0.3mol/l甲基α-d-吡喃葡萄糖苷，ph为7.4。
34.实施例2
35.小麦gsa蛋白纳米颗粒的自组装。
36.以10ml质量分数为10％的nacl溶液为溶剂溶解小麦gsa蛋白，获得终浓度为1μm的gsa蛋白质，磁力搅拌至完全溶解；3000r/min条件下离心10min。取0.7ml上清液，旋涡振荡条件下逐滴分散到2ml分散液(超纯水)中，小麦gsa蛋白即可自组装为纳米蛋白颗粒。
37.小麦gsa蛋白-姜黄素复合纳米颗粒的自组装。
38.为优化小麦gsa蛋白-姜黄素自组装复合纳米颗粒的条件，采取不同的nacl浓度(质量分数分别为5％、7.5％、10％、12.5％、15％)、分散液的ph值(6.5、7.0、7.5)制备小麦gsa蛋白-姜黄素复合纳米颗粒。
39.优选的，采取质量分数为10％的nacl溶液将gsa蛋白质溶解，以获得终浓度为1μm的小麦gsa蛋白质，磁力搅拌至其完全溶解，在分散液ph值为7.0的条件下制备包覆姜黄素的小麦gsa蛋白纳米颗粒。在小麦gsa蛋白溶液中，以一定浓度比(1∶1、1∶2、1∶5、1∶10)的比例向其中加入姜黄素，并持续50℃恒温搅拌2～3h，让其充分溶合，得姜黄素-小麦gsa蛋白混合溶液，经离心分离，去上清液，冷冻干燥即得粉末状姜黄素-小麦gsa蛋白复合纳米颗粒。制备过程应避光，避免姜黄素见光分解。
40.实施例3
41.小麦gsa蛋白和姜黄素结合力的测定。
42.小麦gsa蛋白溶液和姜黄素溶液在不同温度(298k、303k、310k)按一定比例(1∶1、1∶2、1∶5、1∶10)混合2小时。gsa的终浓度为1μm，其中gsa的分子量为56.16kda，姜黄素素的浓度为1μm、2μm、5μm、10μm。激发光谱设置在280nm，发射光谱从320nm到500nm，记录温度为298k、303k、310k。
43.通过激发酪氨酸(tyr)、苯丙氨酸(phe)和氨酸(trp)残基，发现该蛋白质具有内在荧光，这种内在荧光可用于结合相互作用指数。在280nm的激发波长下，氨酸和酪氨酸残基将被激发。蛋白质和小分子的结合会导致荧光发射减少。小麦gsa蛋白与不同浓度姜黄素结合的荧光光谱如图1所示。随着姜黄素浓度的增加，荧光强度不断下降，并出现轻微的红移。这表明gsa与姜黄素的结合改变了氨酸和酪氨酸残基周围微环境的极性。
44.荧光猝灭可分为动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭过程可以通过stern-volmer方程来区分：
45.f0/f＝1+k
sv
[q]＝1+kqτ0[q]
ꢀꢀ
(1)
[0046]
其中f0和f分别是姜黄素不存在和存在时体系的gsa荧光强度；[q]是猝灭剂姜黄素的浓度；kq是荧光猝灭速率常数。k
sv
是stern-volmer动态猝灭常数，由f0/f与[q]的曲线
的线性回归确定；τ0是猝灭剂不存在时荧光物质的平均寿命；根据stern-volmer方程绘制出不同温度下的f0/f～[q]曲线，如图2所示，结果显示，随着温度的升高，曲线斜率增大，表明猝灭机理为动态猝灭。
[0047]
三个温度(298k、303k和309k)的k
sv
、kq和回归系数r2的值均大于0.99，如表1所示，表明该线性方程适用于猝灭建模。
[0048]
表1 gsa和姜黄素在不同温度下的相互作用猝灭常数
[0049]
t(k)k
sv
(105l/mol)kq(10
13
l/mol*s)r22981.39811.39810.99623032.02112.02110.99013103.06363.06360.9996
[0050]
静态猝灭机制、结合常数和结合位点数量的值可以从lineweaver-burk方程得出：
[0051]
log[(f
0-f)/f]＝log(ka)+nlog[q]
ꢀꢀ
(2)
[0052]
其中ka是结合常数，[q]是姜黄素素的浓度，n是结合位点的数量。根据方程分别在298k，303k，310k温度下做log[(f0-f)/f]～log[q]的双对数图，如图3所示，根据截距和斜率求得不同温度下的ka和n。如表2，在298k，303k，310k温度下姜黄素与gsa的n接近1，ka值为106数量级，说明姜黄素与gsa具有一个结合位点数。姜黄素与gsa有较强的结合作用，这也表明gsa与姜黄素有很强的相互作用。
[0053]
表2不同温度下gsa和姜黄素的相互作用结合常数和相应的热力学参数
[0054][0055]
为了确定gsa和姜黄素之间的作用力，温度相关的热力学参数(δg、δh和δs)使用以下等式计算：
[0056]-lnk＝-δh/rt+δs/r
ꢀꢀꢀꢀ
δg＝δh-tδs
ꢀꢀ
(3)
[0057]
其中r是气体常数(8.314j/mol*k)，t是实验温度。如表2所示，δs和δh的正值表明gsa与姜黄素结合的主要驱动力是疏水相互作用。此外，δg＜0表明gsa与姜黄素的结合是一个自发的过程。
[0058]
实施例4
[0059]
小麦gsa蛋白-姜黄素复合纳米颗粒的光稳定性测定。
[0060]
准确称取0.93mg姜黄素与14.96mg小麦gsa蛋白-姜黄素复合纳米颗粒，分别置于培养皿中用30w紫外灯近距离照射，于0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h取样，分别用10％氯化钠溶液溶解并定容至250ml，取10ml所制得的溶液，测定426nm波长处的吸光度，测定3次取平均值。
[0061]
如图4所示，紫外光的照射导致复合纳米颗粒样品吸光度较姜黄素样品吸光度下降速度放慢，紫外线照射至第2小时，导致姜黄素吸光度迅速下降至0.606，随后下降速度放
缓，在第5小时和第6小时，吸光度分别为0.252和0.214。
[0062]
经过6h紫外照射后，姜黄素的吸光度下降75％，而复合颗粒的吸光度下降54％，由此说明，与姜黄素相比，复合颗粒光稳定性较好。6h的紫外光照射使姜黄素光稳定性提高21％，并延长释放时间，这是因为姜黄素与小麦gsa蛋白发生相互作用后，使小麦球蛋白在结构上对姜黄素分子起到保护作用，降低了其对光的敏感度，从而在一定程度上提高了结合后姜黄素的光稳定性。
[0063]
实施例5
[0064]
姜黄素在细胞实验中的生物活性测定。
[0065]
姜黄素已被证明具有强大的抗炎、抗突变和抗癌特性。近年来，姜黄素逐渐被认为是一种能调节免疫细胞活化的多能免疫调节剂。有研究探讨了姜黄素对动物体内免疫细胞的作用及其机制，发现姜黄素处理免疫细胞会显著降低树突状细胞产生的细胞因子。在此研究基础上，利用树突状细胞与姜黄素的作用，做出了以下实验。
[0066]
将树突状细胞dc2.4用ova卵清蛋白处理，使其致敏，再分别用姜黄素以及小麦gsa蛋白-姜黄素复合纳米颗粒作为实验组，对细胞进行培养24小时，对其进行相关实验。从细胞中提取出总的rna，按照说明书进行逆转录，得到相关细胞的cdna，采用实时荧光定量pcr系统进行定量逆转录聚合酶链式反应(qrt-pcr)。
[0067]
如图5所示，与未处理细胞相比，ova刺激24小时的dc2.4细胞产生了更高水平的相关促炎细胞因子(如il-6)，姜黄素对ova产生的过敏作用有一定的缓解效果，小麦gsa蛋白-姜黄素复合纳米颗粒对ova产生的过敏作用相较于姜黄素单独刺激，缓解效果更好，上述结果表明，暴露于姜黄素后，树突状细胞产生大量促炎细胞因子的能力被削弱，小麦gsa蛋白-姜黄素复合纳米颗粒在缓解作用过程中提高了姜黄素的生物可及性，提高了姜黄素在细胞中作用效果及时间。

技术特征：

1.一种基于球蛋白1s的纳米运载体系，其特征在于，所述纳米运载体系包括载体和疏水性植物多酚类物质，所述载体为球蛋白1s，所述疏水性植物多酚类物质为姜黄素或橙皮素。2.如权利要求1所述基于球蛋白1s的纳米运载体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将球蛋白1s溶解nacl溶液中，磁力搅拌至完全溶解，得到混合溶液；(2)自组装：将步骤(1)中混合溶液离心，取上清液分散到分散液中进行自组装，即得球蛋白1s分散液；(3)向(2)中球蛋白1s分散液加入疏水性植物多酚类物质，充分混合后离心，去上清液后即得基于球蛋白1s的纳米运载体系；其中所述疏水性植物多酚类物质为姜黄素或橙皮素。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中加入的疏水性植物多酚类物质与球蛋白1s的浓度比范围为1～10∶1。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中分散的方法为：将离心后的上清液逐滴分散到分散液中。5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中上清液与分散液的体积比为2～5∶1。6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述分散液的ph值为6.5～7.5。7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中nacl溶液的质量分数为5％～15％。8.如权利要求1所述的基于球蛋白1s的纳米运载体系在功能性食品或药物中的应用。

技术总结

本发明公开了一种基于球蛋白1S的纳米运载体系、制备方法及应用，涉及生物技术领域。一种基于球蛋白1S的纳米运载体系的制备方法，包括以下步骤：将球蛋白1S溶解NaCl溶液中，磁力搅拌至完全溶解，得到混合溶液；自组装：将混合溶液离心，取上清液分散到分散液中进行自组装，即得球蛋白1S分散液；向球蛋白1S分散液加入疏水性植物多酚类物质，充分混合后离心，去上清液后即得基于球蛋白1S的纳米运载体系。本发明所述的基于球蛋白1S的纳米运载体系通过小麦GSA蛋白作为输送系统，例如，包埋姜黄素将其制成颗粒，目的为增加姜黄素的稳定性，以延长其释放时间，提高姜黄素及其产品在食品和药品中的应用价值。品中的应用价值。品中的应用价值。