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一种兔用新型水溶性复合佐剂的制备方法及应用

971p)，左旋咪唑，新鱼腥草素钠，聚肌胞苷酸(poly i:c)。
14.该水溶性复合免疫佐剂中各组分的浓度为：以重量计，卡波姆添加量为1mg/ml-50mg/ml，左旋咪唑的添加量为0.1mg/ml-2.0mg/ml，新鱼腥草素钠添加量为0.3mg/ml-1.5mg/ml，聚肌胞苷酸添加量为0.2mg-1.7mg/ml。
15.水溶性复合免疫佐剂中各组分母液配制：
16.(1)左旋咪唑母液：称取适量盐酸左旋咪唑干粉溶解于灭菌注射用水中，配制成100mg/ml的兽用盐酸左旋咪唑液，116℃湿热灭菌30min后作为左旋咪唑母液，4℃保存备用；
17.(2)新鱼腥草素钠母液：称取适量新鱼腥草素钠晶体粉末溶解于灭菌磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为300mg/ml的新鱼腥草素钠母液，过0.22μm滤膜除菌后4℃保存备用。
18.(3)聚肌胞苷酸(poly i:c)母液：称取适量聚肌胞苷酸(poly i:c)粉末，溶解于灭菌磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为50mg/ml的聚肌胞苷酸(poly i:c)母液，过0.22μm滤膜除菌后4℃保存备用。
19.水溶性复合免疫佐剂采用以下方法制备：将卡波姆加入蒸馏水中配置卡波姆胶冻物，具体制备过程为：称取卡波姆加至蒸馏水中，待充分溶胀后，混匀，调节ph至7.0，高温高压灭菌，灭菌的条件为110-121℃高压灭菌20-40min，然后再无菌加入其他组分过滤除菌母液，加灭菌蒸馏水定容并充分搅拌混匀，2-8℃保存。
20.进一步优选的，所述的卡波姆为卡波姆971。
21.上述的水溶性复合免疫佐剂在制备疫苗中的应用。所述的疫苗优选为兔出血症病毒杆状病毒载体复合水佐剂灭活疫苗(bac-vp60株)(以下简称兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗)。一种疫苗组合物，包含上述的水溶性复合免疫佐剂和免疫原。所述的免疫原优选为重组兔出血症病毒vp60杆状病毒(bac-vp60株)灭活抗原。所述的重组兔出血症病毒vp60杆状病毒(bac-vp60株)灭活抗原为灭活的rhdv1vp60重组蛋白。
22.3.有益效果
23.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
24.本研究以rhdv 1vp60重组蛋白为基础，研制兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗，进行兔免疫试验。结果表明，该复合水佐剂疫苗能诱导机体产生rhdv1特异的体液和细胞免疫应答，在免疫吸收、抗体效价、最小免疫剂量及制苗成本方面均优于传统铝胶佐剂，可以有效提供对该病的免疫保护作用，具有重要研究开发前景。
附图说明
25.图1为本发明中兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗及对照疫苗免疫后rhdv抗体效价(log2)消长趋势图；
26.图2为本发明中兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗不同免疫剂量产生的rhdv抗体效价(log2)图。
具体实施方式
27.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
28.实施例
29.1、兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗配制
30.(1)卡波姆母液制备：用超纯水将卡波姆971(购自西宝生物科技(上海)股份有限公司)粉末膨胀过夜，调节ph至7.0，然后用灭菌pbs定容至6mg/ml，120℃，20min高压灭菌，灭菌后备用。
31.(2)复合水佐剂制备：在卡波姆母液中加入过滤除菌的其他组分母液，使各组分终浓度为：以重量计，卡波姆添加量为1mg/ml-50mg/ml，左旋咪唑的添加量为0.1mg/ml-2.0mg/ml，新鱼腥草素钠(购自北京索莱宝科技有限公司)添加量为0.3mg/ml-1.5mg/ml，聚肌胞苷酸添加量为0.2mg-1.7mg/ml。加灭菌蒸馏水定容并充分搅拌混匀，2-8℃保存。
32.(3)将复合水佐剂与兔瘟抗原液按体积比3：7混匀，制备成卡波姆终浓度为1-50mg/ml的兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗。
33.2、兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗稳定性质量评价
34.(1)制备的疫苗10000转/分离心20min后仍维持澄清、半透明、均一的外观，未见分层现象，颜和澄清度均无变化，表明该疫苗稳定性良好。
35.(2)兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗的外观：性状澄清、半透明，均一，在烧杯中晃动无挂壁现象，流动性良好。
36.(3)兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗黏度测定：取出1ml玻璃吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)，在25℃下吸取复方水佐剂疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，测定三次，取平均值为2.9秒，在疫苗黏度允许的范围之内(《8s
·
0.4ml-1
)。
37.(4)兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗的稳定性考察：各取3批该疫苗分别在37℃条件放置1个月，4℃、20℃放置6个月，复方水佐剂疫苗外观均保持澄清半透明液体，无絮状、分层现象；10000r/min离心20min后，仍为澄清半透明均一液体，表明其稳定性良好。取3批该疫苗于-20℃冰箱冻融，观察结果显示冻融后复方水佐剂疫苗外观仍保持澄清半透明液体，无絮状、分层现象，表明其稳定性良好。
38.3、兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗安全性试验
39.(1)结合表1，选取10只2-3月龄健康易感家兔(兔出血症病毒抗体hi效价不高于1：2)，分为三组，每组5只。第一组：每只颈部皮下注射2ml兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗；第二组：每只颈部皮下注射2ml铝胶佐剂制备的兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(bac-vp60株)(以下简称兔瘟基因工程铝胶佐剂灭活疫苗)；对照组：每只颈部皮下注射2ml灭菌生理盐水作为空白对照，连续观察14日，所有实验兔精神状态、饮食、粪便等均正常，免疫兔未出现疫苗接种引起的任何局部和全身反应。
40.表1兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗安全性评价
41.组别数量死亡数量兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗50兔瘟基因工程铝胶佐剂灭活疫苗50空白对照组50
42.4、兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗有效性试验
43.选取2-3月龄健康易感家兔(兔出血症病毒抗体hi效价不高于1：2)30只，分为3组，每组10只，分别为兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗免疫组、兔瘟基因工程铝胶佐剂灭活
疫苗免疫组、空白对照组。疫苗免疫组试验兔各颈部皮下注射对应佐剂疫苗1ml，空白组实验兔经同样途径注射灭菌生理盐水1ml。
44.(1)抗体效价比较
45.结合表2，分别在免疫后7、14、28、90、150、210、270d从每组中随机抽取5只试验兔于耳静脉采血后分离血清，通过血凝抑制试验(hi)测定血清中兔病毒性出血症抗体效价。结果以“平均值
±
标准差”表示。结果显示兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗和兔瘟基因工程铝胶佐剂灭活疫苗均能产生较高水平的rhdv抗体效价，且两种疫苗抗体消长趋势基本一致，兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗产生的抗体水平稍高于兔瘟基因工程铝胶佐剂灭活疫苗。
46.表2兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗及对照疫苗免疫后rhdv抗体效价(log2)
[0047][0048][0049]
(2)免疫攻毒保护比较
[0050]
在7、14、28、60、150、210d、270d采血后的5只试验兔分别经颈部皮下注射兔病毒性出血症病毒皖阜株肝毒(病毒含量≥10
5.5
ld50/ml，或ha效价不低于1:256)，剂量为1ml/只，隔离饲养，观察7d，记录各组兔的发病和死亡情况，计算各组兔保护率，比较2种疫苗的免疫保护效果。结果显示免疫后7个月，兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗和兔瘟基因工程铝胶佐剂灭活疫苗保护率均达100％，免疫后9个月攻毒实验结果显示，兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗保护率为80％，兔瘟基因工程铝胶佐剂灭活疫苗保护率为60％。
[0051]
表3兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗及对照疫苗免疫后攻毒保护结果(存活数/攻毒数)
[0052]
组别7d14d28d90d150d210d270d兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗5/55/55/55/55/55/54/5兔瘟基因工程铝胶佐剂灭活疫苗5/55/55/55/55/55/53/5空白对照组0/50/50/50/50/50/50/5
[0053]
5、兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗注射部位吸收检查
[0054]
分别在免疫后7、14、28、90、150、210d、270d从每组中取5只试验兔用于剖检观察注射部位疫苗吸收情况。结果显示，在免疫后28天检查时注射部位，兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗免疫组已100％吸收，兔瘟基因工程铝胶佐剂灭活疫苗组60％吸收，水佐剂组疫苗吸收情况优于铝胶佐剂。
[0055]
表4兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗及对照疫苗免疫后吸收情况
[0056][0057]
6、兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗最小免疫剂量试验
[0058]
选取2-3月龄健康易感家兔(兔出血症病毒抗体hi效价不高于1：2)25只，分为5组，每组5只，分别为1剂量免疫组(1ml)、1/2剂量免疫组(0.5ml)、1/4剂量免疫组(0.25ml)、1/10剂量免疫组(0.1ml)、1/20剂量免疫组(0.05ml)。
[0059]
分别在免疫后14d对每组5只试验兔于耳静脉采血后分离血清，通过血凝抑制试验(hi)测定血清中兔病毒性出血症抗体效价。同天对采血后的5只试验兔分别经颈部皮下注射兔病毒性出血症病毒，剂量为1ml/只，隔离饲养，观察7d，记录各组兔的发病和死亡情况，计算各组兔保护率，比较不同剂量保护效果，同时结合图1与图2。
[0060]
表5兔瘟基因工程复合水佐剂灭活疫苗不同免疫剂量14天免疫效果评价
[0061][0062]
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

技术特征：

1.一种兔用新型水溶性复合佐剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：准备卡波姆、左旋咪唑、新鱼腥草素钠及聚肌胞苷酸；将卡波姆加入蒸馏水中配置卡波姆胶冻物，无菌状态下加入其他组分并过滤除菌，加灭菌蒸馏水定容并充分搅拌混匀，2℃-8℃保存。2.根据权利要求1所述的兔用新型水溶性复合佐剂的制备方法，其特征在于：其中所述的卡波姆为卡波姆971。3.根据权利要求1所述的兔用新型水溶性复合佐剂的制备方法，其特征在于：其中所述的左旋咪唑的制备方法如下：称取适量盐酸左旋咪唑干粉溶解于灭菌注射用水中，配制成100mg/ml的兽用盐酸左旋咪唑液，116℃湿热灭菌30min后作为左旋咪唑母液，4℃保存备用。4.根据权利要求1所述的兔用新型水溶性复合佐剂的制备方法，其特征在于：其中所述的新鱼腥草素钠的制备方法如下：称取适量新鱼腥草素钠晶体粉末溶解于灭菌磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为300mg/ml的新鱼腥草素钠母液，过0.22μm滤膜除菌后4℃保存备用。5.根据权利要求1所述的兔用新型水溶性复合佐剂的制备方法，其特征在于：其中所述的聚肌胞苷酸的制备方法如下：称取适量聚肌胞苷酸粉末，溶解于灭菌磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为50mg/ml的聚肌胞苷酸母液，过0.22μm滤膜除菌后4℃保存备用。6.根据权利要求1所述的兔用新型水溶性复合佐剂的制备方法，其特征在于：其中将卡波姆加入蒸馏水中配置卡波姆胶冻物的具体制备过程为：称取卡波姆加至蒸馏水中，待充分溶胀后，混匀，调节ph至7.0，高温高压灭菌，灭菌的条件为110℃-121℃高压灭菌20min-40min。7.根据权利要求1所述的兔用新型水溶性复合佐剂的制备方法，其特征在于：其中制备的复合佐剂中各组分添加量如下：卡波姆添加量为1mg/ml-50mg/ml，左旋咪唑的添加量为0.1mg/ml-2.0mg/ml，新鱼腥草素钠添加量为0.3mg/ml-1.5mg/ml，聚肌胞苷酸添加量为0.2mg-1.7mg/ml。8.一种如权利要求1-7所述的制备方法所得的兔用新型水溶性复合佐剂。9.一种如权利要求8所述的兔用新型水溶性复合佐剂在制备兔瘟疫苗中的应用。10.根据权利要求9所述的兔用新型水溶性复合佐剂在制备兔瘟疫苗中的应用，其特征在于，所述的兔瘟疫苗包括所述的兔用新型水溶性复合佐剂、重组兔出血症病毒1型vp60杆状病毒抗原。

技术总结

本发明公开了一种兔用新型水溶性复合佐剂的制备方法及应用，属于兽医学技术领域。所指水溶性复合佐剂由高分子聚合物、化合物类免疫增强剂、中药类免疫增强剂、生物类免疫增强剂组成。本发明的有益效果是，与常规铝胶佐剂、油佐剂相比，不仅能够刺激机体产生更强的体液免疫和细胞免疫应答，避免了因油佐剂疫苗粘稠引起的注射部位吸收不良，铝胶佐剂注射局部炎症反应引起的肉芽肿，且成本较传统佐剂更低，佐剂来源更稳定。新型水溶性复合佐剂配苗前后可冷冻保存，可有效提高兔用疫苗的稳定性、安全性和有效性，更好保障养殖户经济效益。更好保障养殖户经济效益。更好保障养殖户经济效益。