热流道温控器许灵春;杨文蒿;孙和龙;窦诗雯;敬国兴
【摘 要】包边角钢
Alternaria alternata is a common pathogen causing grapes postharvest decay, the producing mycotoxins will cause safe hazards to human health.In this study, the strain (A-0913) was isolated from the surface of rotten redglobe table grapes fruit and purified in PDA medium.According to the results of morphological characterization and 5.8S rDNA-ITS gene sequence analysis, A-0913 was identified as A.alternata.Meanwhile, we have explored the basic biological characteristics of the strain and detection methods of toxin.The experiment results showed that the logarithmic growth phase of A-0913 was reached at 36 h, the optimal growth temperature for the mycelium was 25 ℃, and the neutral or low alkaline cultre conditinos were favorable for the growth of the mycelium.Further expriment showed that two of the most common A.alternata mycotoxins (alternariol and alternariol monomethyl ether) were detected in this strain after extraction.%链格孢菌是导致葡萄采后腐烂的一种重要病原菌,且其产生的真菌毒素会对人体健康造成安全 隐患.本研究从自然发病的葡萄果实中分离纯化出一株侵染菌株(A-0913),根据真菌的形态学特征并结合5.8S rDNA-ITS基因序列分析确定该菌株属于链格孢菌(Alternaria alternata).同时,对该菌株基础生物学特性及其毒素检测的研究结果表明:该菌丝体最适生长温度为25 ℃,中性或偏碱性环境均有利于菌丝体的生长, PDA培养基中培养36 h后可达对数生长期.研究发现该菌株具有产毒素的性能,通过进一步优化真菌毒素HPLC检测条件发现该链格孢菌株主要产AOH和AME两种真菌毒素.海洋工程船
【期刊名称】《湘潭大学自然科学学报》
【年(卷),期】2017(039)002
【总页数】6页(P49-54)
【关键词】链格孢;形态学特征;5.8SrDNA-ITS;毒素
【作 者】许灵春;杨文蒿;孙和龙;窦诗雯;敬国兴
【作者单位】湘潭大学 化工学院,湖南 湘潭 411105;湘潭大学 化工学院,湖南 湘潭 411105;
湘潭大学 化工学院,湖南 湘潭 411105;湘潭大学 化工学院,湖南 湘潭 411105;湘潭大学 化工学院,湖南 湘潭 411105
【正文语种】中 文
【中图分类】O152.1
葡萄是中国栽培最普遍的三大水果之一，同时也是经济林中干鲜果品类的主要林木，具有很大的经济价值.产区主要集中在西北、华中、华北、东北南部和黄淮海地区，成熟期主要集中在8、9月份.采后葡萄在常温下极易腐烂，引起腐烂的病原菌主要有：灰霉病、霉腐病、青霉病和黑粉病等采后真菌病害[1].其中霉腐病由链格孢菌(Alternaria spp.)引起，此类真菌属于丝状真菌，是普遍存在于水果、蔬菜等的病原体和腐生菌，其可产生多种次级代谢产物，其产生的真菌毒素对人或牲畜具有诱变性、致癌性和致畸性等慢性或急性毒性作用[2].链格孢酚(Alternariol，AOH)、链格孢酚单甲醚(Alternariol Monomethylether，AME)和细交链孢菌酮酸(Tenuazonic Acid，TeA)为链格孢菌中3种主要的二苯并吡喃酮类非寄主特异性毒素[3-4].目前，关于抑制链格孢病菌生长已有少数相关的报道[5]，但相关的抑菌机理及影响真菌毒素合成的报道不多.
本研究从本地区采后葡萄果实中分离纯化了一株供试菌株A-0913，通过菌落形态及分子生物学鉴定其属于链格孢属病菌，并研究了此菌株真菌毒素提取及检测的方法，以期为后续葡萄采后链格孢病菌防治及真菌毒素合成抑制相关的基础理论研究奠定基础.
1.1 材料、试剂与仪器
1.1.1 实验材料 供试材料为红提葡萄(Redglobe table grapes)果实，采摘于湘潭大学附近果园.
1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：100 g马铃薯煮沸后用4层纱布过滤，再加入10 g葡萄糖，10 g琼脂，蒸馏水定容到500 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min；马铃薯葡萄糖培养基(PDB)：100 g马铃薯煮沸后用4层纱布过滤，再加入10 g葡萄糖，蒸馏水定容到500 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min.
1.1.3 试剂与仪器 AOH，AME，TeA标准品(纯度 > 99 %，新加坡Pribolab公司)；乙腈(谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；甲醇(谱纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；甲酸(谱级)和无水MgSO4(分析纯)均订购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；NaCl(分析纯，国药集团化学试剂有限公司). LC-20AT型高效液相谱仪，SPD-M20A二极管阵列检测器，C18谱柱(日本岛津公司).
1.2 方法
1.2.1 致病真菌的分离与纯化 采用组织分离法[6]分离菌种，在无菌操作台上将自然发病的葡萄果实用75 %酒精进行表面消毒3 ～ 5 s，再放入0.1 %次氯酸钠溶液中消毒2 min，最后用无菌水冲洗3次，用解剖刀在病健交界处切取0.5 cm× 0.5 cm腐烂组织植入PDA培养基，置于25 ℃恒温箱培养2 ～ 3 d.当培养出的菌落直径为1 cm时，用接种针在菌落边缘挑取少量菌丝植入新PDA培养中，重复上述操作后分离的菌株A-0913即可作为供试菌种后续实验备用. 1.2.2 致病真菌形态学鉴定 将供试菌株接种到PDA 固体培养基中，25 ℃恒温倒置培养4 ～ 5 d.记录致病真菌的菌落直径大小、颜变化等特征，并制作菌丝压片，在显微镜下观察其菌落、菌丝和孢子的形态特征，并根据真菌形态学鉴定手册[7]进行初步鉴定.
1.2.3 致病真菌的分子学鉴定
(1)致病真菌基因组DNA提取
将供试菌株接种到PDA 平板上，在培养箱中于25 ℃恒温培养5 d，用6 mm的圆形打孔器在菌落边缘取多个菌丝块，接种到100 mL PDB液体培养基中，25 ℃条件下150 r/min震荡培养3 d，将培养的菌液于4 000 r/min下离心10 min，无菌水洗涤3次后用循环水真空泵抽滤菌丝，致病真菌基因组DNA提取参照刘艳梅等[8]改进的氯化苄法.
(2)PCR扩增
PCR扩增使用2×Taq PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)试剂盒.采用25 μL反应体系，1 μL Template，1 μL Primer 1，1 μL Primer 2，1.25 μL 2×Taq PCR MasterMix，加ddH2O至25 μL.5.8S rDNA-ITS扩增所需引物为ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[9].PCR扩增反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸5 min.扩增产物用1.2 %的琼脂糖凝胶、1×TAE 电泳缓冲液，上样5 μL 检测，DNA Marker Ⅲ(上海研拓生物科技有限公司)指示分子量，凝胶成像仪观察并照相，将克隆片段送至苏州泓迅生物科技有限公司进行测序分析.
1.2.4 致病真菌生物学特性
汽车指纹防盗(1)致病真菌生长曲线
将供试真菌接种于PDA培养基中培养5 d后，用6 mm圆形打孔器取3个菌苔并将其置于100 mL PDB液体培养基中， 25 ℃、150 r/min恒温振荡培养.每12 h取出菌丝体真空抽滤，称量菌丝体重量，共计录108 h.每组设置3个重复，结果取平均值.
(2)温度对致病真菌的影响
将供试真菌接种于PDA培养基中培养5 d后，取其中菌苔(直径6 mm)置于新PDA培养基中央，分别放置于10、15、20、25、30、35 ℃恒温培养箱中培养3 d，用十字交叉法测量菌斑直径，每个温度梯度设置3个重复，结果取平均值.
(3)pH对治病真菌的影响
将供试真菌接种于PDA培养基中培养5 d后，取其中菌苔(直径6 mm)置于pH分别为4、5、6、7、8、9的PDA培养基中央.置于25 ℃恒温培养箱中培养3 d，用十字交叉法测量菌斑直径，每个pH梯度设置3个重复，结果取平均值.
1.2.5 致病真菌毒素提取及检测 样品毒素提取方法参考蒋黎艳[10]，称取已抽滤的供试菌丝体样品1 g(精确至0.01 g)冰浴研磨均匀，置于10 mL具塞离心管中；加入含1 %乙酸的乙腈-水(80∶20，V/V)提取液5 mL，涡旋混匀，150 r/min常温振荡提取60 min，再加入0.5 g无水MgSO4 和0.2 g NaCl，剧烈振荡1 min 后，以4 000 r/min离心10 min，取上清液过 0.22 μm有机滤膜，滤液经液相谱分析.
AOH、TeA和AME标准品用甲醇配制.HPLC检测条件：谱柱C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；柱温40 ℃；流动相体系为1 %甲酸(A)和乙腈(B)；梯度洗脱程序为0 ～ 1 min，20 % ～ 55 % B；1 ～ 16 min，55 % ～ 60 % B；16 ～ 18 min，60 % ～ 80 % B；18 ～ 18.5 min，80 % ～ 20 % B；18.5 ～ 22 min，20 % B.进样量20 μL；流速1.0 mL/min.
2.1 致病真菌的形态学鉴定
供试菌株于25 ℃ PDA 培养基培养3 d后，菌落直径达到3.5 ～ 4.0 cm，菌落平展且呈致密的绒毛状，初期菌丝灰白，后变为浅绿或墨绿，培养基底面为黑或紫黑(图1 A).显微镜形态观察其分生孢子呈卵形、倒棒状、梨形或椭圆，形状变化较大；分生孢子褐或深褐，表面光滑或有瘤，有横膈膜 1～6 个，纵隔膜 0 ～ 5 个，喙大(图1 B).分生孢子
梗直立、分枝或不分枝、淡榄褐至绿褐、有屈曲、顶端常扩大而具多个孢子痕；分生孢子形成长达5个左右孢子所组成的孢子链(图1 C).根据菌落特征和参照《真菌形态鉴定手册》初步确认该菌株A-0913为链格孢霉病原菌.
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