浙江农业学报Ada Agriculturae Zhejiangensis,2021,33(1):104-111htt p：///ww.zjnyxb.c/苏学思，张玉宝，王若愚，等•车前草花叶病毒衣壳蛋白的原核表达和多克隆抗体制备[J]•浙江农业学报,2021,33 (1):104-111. DOE:10.3969/..issn.1004-1524.2021.01.13车前草花叶病毒衣壳蛋白的原核表达和多克隆抗体制备
苏学思1!2，张玉宝1!**，王若愚1，王亚军S唐国亮金卫杰1!2
(1.中国科学院西北生态环境资源研究院皋兰生态与农业综合试验站，甘肃兰州730000；2•中国科学院大学，北京100049)
摘要：为制备车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic7os,P1AMV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)及其多克隆抗体，采用RT-PCR方法从甘肃省种植的切花百合上克隆了PAMV e基因的部分序列，连接表达载体pET-28v(+)，转化EscHerOHia nil BL21(DE3)菌株，经IETG诱导和Ni-NTA重力柱层析获得了大量纯化的CP融合蛋白，将其作为抗原免疫家兔制备了多克隆抗体。序列分析结果表明,PAMV e基因片段大小为621bp，编码207个氨基酸；与已注册的PAMV分离物相比，核昔酸序列相似性为74.7%〜100%，氨基酸序列相似性达到83.6%〜100%；不同植物PAMV的分离物序列差异明显，病毒种分布呈现寄主差异)SDS-PAGE结果表明，CP蛋白在E.coli BL21(DE3)中大量表达，蛋白相对分子质量为24ku o Western blot结果显示，抗体能够特异结合天然PAMV病毒蛋白，可用于检测感病材料中PAMV蛋白的表达量)本研 更衣凳究可以为PAMV的血清学检测技术开发和致病机理研究提供一定的参考)
关键词：百合；车前草花叶病毒；衣壳蛋白；原核表达；多克隆抗体
中图分类号:S432.4+1；Q786文献标志码:A文章编号:1004-1524(2021)01-0104-08
Prokaryotic expression of Plantago asiatica mosais virus capsid protein and peparhon of id polyclonal antidody
SU Xuesi1,2,ZHANG Yubvo1,*,WANG Ruoyu1,WANG Yajun1,TANG GuoAng1'2,JIE Weijie1'2
(1•Northwest Institute yf Ecn-Eainnmeai and Resources,Chiaese Acodemy sp Sdeacs,Laazhop730000,China；
2.Undersity f Chinese Academy f Sdeacs,Beging100049,China)
Abstract:The cp gene of Plantago asiatica mosaic viro(PAMV)was cloned from an isolate of PAMV,obtained from//growing in Gansu Province,Chine.The cp gene fragment of621bp was constructed into the pokaootic ex-possion vectoo pET-28a(+),and the recombinant plasmid was transformed into EscPerOPia coll BL21(DE3)to express the fusion CP protein.Ateo IETG induction a
nd Ni-NTA gravity column chomatography,purified CP fusion protein was obtained and used as immunogen to prepare a rabbit-derived an/-CP polyclonal antibody.BLAST result showed that the simbaOty of nucleo/de and amino acid sequences of sp gene was up to74.7%一100%and83.6%一100%between the cloned PAMV isolate and the known PAMV isolates,ospectiveA.We noted that cp sequences from dbferent hosts were significan/y dbferent,which suggested the disOiPu/on of PAMV population was intuenced by species of host.SDS-PAGE indicated thvt CP protein was highly expressed ll BL21(DE3),and had a relabve protein mo/cuAo weight of24ku.Western blot result demonstrated that the prepared polyclonal antibody
收稿日期:2020-08-7
基金项目：陇原青年创新创业人才(团队)项目(2020-339)'兰州市人才创新创业项目(2019-HLJC-9)'兰州市城关区科技计划(2019-6-2)作者简介：苏学思(1995—)，男，河南新乡人，硕士研究生，主要从事植物病毒学研究)E-mail：suxuesi18@mails,ucas.ac
*通信作者，张玉宝,E-mail:zyubao@Ab.ac
kuse006
苏学思，等•车前草花叶病毒衣壳蛋白的原核表达和多克隆抗体制备-105-
could successfully capture the natural PAMV capsid proteins,which was used tv check the expression level ot
P1AMV protein in susceptible plant tissue.This work provided a reference for the study ot the pathogenic mechanism
ot PAMV and the development ot seologicat detection techniques for the virus.
Key words:lily；Pleotego asia/cn mosaic virus；capsid protein；prokaryotic expression；polyclonal antibody
车前草花叶病毒"Plantago asia/ca mosaic virus,PAMV#由“015X00等%门于1977年在俄罗斯东地区的前，后来被证实是侵的重要病毒之一。PAMV属于甲状病毒科(AlphefexiviriOae-马铃薯X病毒属(Pot-x V us S成，子下到丝状的病毒，其大小约为(490〜530-nm X(11 -13-nm%2&。该病毒基因组由一条正义单链RNA组成，约为6100nt,54
读框(open reading frame，ORF-%3&)0RF1编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymeose，RdRp-，主要负毒核酸的复制%4&) 0RF2、0RF3和0RF4分别编码230*110*121个氨基酸，组成基因(biple ge/e block potWnr，TGBp-，够帮毒在植物间移 动，并抑制植物的基因沉默作用%5一6&。0RF5由624核核成，毒的衣壳
(capsid protein，CP-，该蛋白由207个氨基酸构成，是毒主要的，毒的移动与侵%7&。
2010年兰报道了PAMV对百合生长的，随后毒在美国、日本、意大利和智利等的被相继％8「13&。PAMV能通机械传播，被的也具有传播该病毒的可能%14&。PAMV的传与植物的或，但清楚是传：介%8&。此外,PAMV寄主广泛，16科的植物，其中，、报、南、地黄、、紫菜等皆为重要的中药材或作物%受PAMV侵染的百合，初期症状主要表现为花叶、、等，后期表现为严重坏死、生：、植矮化等(图1-%14_16&。兰PAMV 的报道中，毒生长的具加严的，造成切花出现碎、状，损失达80%%15&。
间病毒诊断是百合PAMV的主要防治，为控制病毒，迫切需要、特异、灵敏、高的病毒检测技术。目前外PAMV RT-CR方法%16一17&，方
特异性强，高；但是的操作、对技术人的高要求，以及器设备的依赖限制了方法的推广应用。与之相比,ELISA、金免疫层析等血清学方仅具备高特异性和高性的特点，作简单，具
大批品的能力，更适间毒的调查
%18一⑼。通目的基因原核表达载体的方法制备抗原，能克纯毒的困难，提高抗原的纯，利种方法制备的抗体具的特异性价。据此，本研究以感染PAMV的为材料，克隆PAMV cp基因的部分序列，进行
分析。通过构建PAMV cp基因的原核表达载体，转化Escherichia coli BL21(DE3-菌株，经IETG诱导获得了大量纯化的PAMV CP|，并此为抗原制备特性良好的多克隆抗体，以期为PAMV的血清学技术致病机理研究提供一定的参考。
1材料与方法
1.1材料和试剂
感染百合无症病毒(Lily symptomless virus, LSV-、黄瓜花叶病毒(Cucumbee mosaic virus, CMV)、百合斑驳病毒(Lily mottle V us,LM o V-和
图1感染Plootogc osio/co mosole virus的百合
Fig.1Lily infected with Plootogc osio/co mosole virus exhibiting symptoms of rust-brown necrotic strips and
spots
-106-浙江农业学报第33卷第1期
P1AMV的百合样品，以及感染马铃薯X病毒"Po-tatc virus X,PVX）的马铃薯样品均由本实验室保存）
植物总RNA提取试剂盒"RNAprep Pure PAna KP）购自天根生化科技（北京）有限公司；植物蛋白提
取试剂盒购自上海贝博生物科技有限公司；质粒微量抽提试剂盒（E.Z.N.A.®Plasmid DNA Mini Kit I）购自Omega公司；逆转录试剂盒（PrimeScript™RT Reageni Kii）、DNA回收试剂盒（Agamsa Gel DNA Fragmeni Recovery Kii）和克隆载体pMD T M19-C购自宝生物工程（大连）有限公司；NTNTA预装重力柱（Ni-DTA Pre-Packed Gravity Column）和NBT//CIP碱性磷酸酶显试剂盒（蓝）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；E.colt lt BL21（DE3）菌株和表达载体pETA8a（+）由本实验室保存。
1.2引物设计与P1AMV t序列的克隆
根据NCBI公布的百合P1AMV cp基因序列（GenBank登录号:KX245539），采用Pymaz Premiaz 5软件和OUga7软件设计如下特异性引物（下划线表示引入的酶切位点BamH I和Sal I）:F：5'末C GGATCC ATGGCACTCAACCAAGCCA'；R：5'-CTT GTCGAC ATCGGAGGGGGAGGGGAA'弓|物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）植物RNA提提RNA，
据逆转录试剂盒说明合成P1AMV第-链cDNA，再以第1链cDNA为模板，通过RTACR扩增P1AMV t基因。扩增条件为：94°C预变性4 mP；94C变性30s,58C退火45s,72C延伸1 min，循环扩增30次；72C延伸7min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，通过DNA回收试 剂盒回收目的片段；纯化片段连接T载体，转化E.colt DH5a o提取重组质粒，经PCR和双酶切验证后，阳性质粒送北京擎科新业生物
技术有限公司测序，测序证实序列正确后命名为pMD19-T-C1AMV，并借助BLAST、CAstalW和DNAStaz软件进行序列比对、分析，以及P1AMV CP蛋白的抗原表位预测。
1.3原核表达载体的构建
用限制性内切酶BamH I和Sal I双酶切pMD19-P-ClAM V质粒和pETA8a（+）质粒，经1.5%脂后通DNA 剂盒纯化目的片段，16C连接。连接产物转化E.colt DH5a，涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，然后挑选单克隆进行PCR验证。阳性菌落扩大培养提取质粒，经限制性内切酶BamH I和So-I双酶切、-.%琼脂糖凝胶电泳检测后，将阳性质粒命名为pET-28a-ClAMV o未经酶切处理的pET-28a-ClAM V质粒作为双酶切鉴定阳性克隆的对照。
1.4P1AMV CP蛋白的原核表达
取pET-28a-ClAM V质粒转化E.colt BL21（DE3）菌株，挑取单克隆接入含有卡那霉素的LB 液体培养基中培养。第2天按照体积比1：100接种于同样的培养基,37C*220z-min_1摇床振荡培养。当D600为0.7时，分别加入0、0.5、1.0、1.5和2.0mmoAL"IFTG诱导蛋白表达，诱导4 h后收集菌体进行SDSAAGE电泳。相同条件诱导未插入目的基因的E.colt BL21（DE3）菌株表达蛋白作为阴性对照。
为获得纯化的P1AMV CP蛋白，按照同样的实验条件，诱导培养1L菌体。收集菌体后，首先用0.01mo
AL—1PBS溶液悬浮菌体，然后使用超声机破碎至菌液澄清透亮，接着离心后取上清，最后按照Ni-NTA重力柱操作指南纯化目的蛋白。
1.5P1AMV CP多克隆抗体的制备
用纯化的P1AMV CP蛋白（1mg•mL"1）作为免疫原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。具体免疫情况如下：将1mg纯化蛋白和完全弗氏佐剂（初次免疫）或不完全弗氏佐剂（增强免疫）等量混合均匀，进行皮下多点注射。共进行4次免疫，每次免疫间隔21d，第4次免疫2周后取全血，分离得到抗血清。间接ELISA测定效价, Pmtein A亲和层析柱纯化兔抗血清，从而获得兔抗P1AMV多克隆抗体IgG。
1.6P1AMV CP多克隆抗体的鉴定
称取0.1-0.2g健康和分别感染LSV、CMV、LMoV和P1AMV的百合叶片，以及感染PVX的马铃薯叶片，加入液氮研磨，按照植物蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白。蛋白样品经煮沸变性后进行SDSAAGE电泳，采用湿转法将目的蛋白于15V恒压下转移至PVDF膜，转膜后移入5%脱脂奶粉配制的封闭液中4C封闭。以制
苏学思，等.车前草花叶病毒衣壳蛋白的原核表达和多克隆抗体制备-107-
备的PAMV CP多克隆抗体作为一抗(1：1000),AP 标记的羊抗兔EG作为二抗(1：10000)，通过NBT//C
IE碱性酶显(蓝)显。
2结果与分析
2.1PAMV cp序列的克隆
以侵染东方品种Robbia的PAMV 基因组RNA为,RT-CR扩增PAMV cp基因的部分。，扩增段的大小为500〜750bp，与预期的PAMV cp基因大小一致(621bp)(2))
2.2序结果与序列分析
对阳性pMD-19T重组质粒分别从两端进行测序。表明，与
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PAMV cp基因序列(KX245539)的相似性达到100%o与GenBank中的PAMV cp基因行比较，发现各分物之间核昔酸的相似性为74.7%-100%，氨基的似性为83.6%-100%°其中，甘肃皋兰分离物(克隆所)与PAMV分离物关，核似性为85.7%-100%,
基似性为92.8%-100%；与紫菜(LC155796)、南天竹(LC155795)、车前草(KU697313)、地黄(KY923700)和报春花(AB360796)等他植物PAMV分离物的关较远，核似性为74.7%-86.4%，氨基似性为83.6%〜93.7%°
NCB【中选植物PAMV分离物的cp 序列，(NJ法)(3),
M,DNA2000marker；1，阴性对照；2,P1AMV cp基因。
M,DNA2000marker；1,Neva/ve control；2,P1AMV cp gen—
图2PAMV cp基因的PCR扩增结果
Fig.2PCR amplification result of PAMV cp gene 分析甘肃皋兰分离物与其他植物分离物之间的°表，PAMV分离物显分为2个大。第1大，百合的PAMV cp序聚为分支，烟、车前、地黄的PAMV cp丿聚为分支；而紫菜的PAMV cp序列，相比他分离物，单独被分为大组；表明PAMV的种分布表现出寄主之间的差异性。
分离物聚成的分支内部，甘肃皋兰分物与中国(KX245539)、韩国(KU159091)、荷兰(KU870359)、意大利(LN651194)英国(MK005151)的分离物具有较近的，而与日本百合分离物(AB360790-AB360795)的亲较远°表PAMV的种分布存区°
2.3PAMV CP蛋白的抗原表位预测
NCBE选具PaAMV c的分离物进行ClustalW比对，似性达到90%的基°通DNAStar7.1件分析甘肃皋兰
分离物PAMV CP蛋白的二级性质，抗表位(图4)°选择抗原性指数较高(指数&0)、水性好(指数&0)、性好(指数&0)具$转角或则结的区域作为抗原表位(氨基酸数量&4)°页测
表明，抗表位由35基成，其中28是基酸，表PAMV CP蛋白的抗原表°
2.4重组原核表达载体的构建
PCR扩增pET-28a重组质粒，得到约600bp 的目的片段，与预期的PAMV cp序列大小一致(621bp)°核表达BomH I和Sal I 切割后2带，期大小的目的片段(621bp)，表核表达成功(图5)°2.5PAMV CP蛋白的表达与纯化
取pET-28a-CAM V质粒转化 E.coli BL21 (DE3),IETG诱导后，收集行SDS-PAGE电泳。在IETG诱导下，预期大小的处的表达(图6-A)°但是随着IETG 浓度从0.5mmoAf1逐渐增加到2.0mmoAf1，目的表达。扩大培养1'菌体，经Ni-NTA重力柱纯PAMV CP蛋白，非特异性条带产生(图6-C)°
2.6ELISA测定
效价
-108-浙江农业学报第33卷第1期
99100
23
14
73
100
100
—AB360793(L/7/t/m maximowiczii Regel)
AB360794(L/7/t/m maximowiczii Flegel)
AB360792(L/7/t/m maximowiczii Flegel)
AB360790(L/7/t/m maximowiczii Regel)
AB360791(Lilium maximowiczii Flegel)
-AB360795(L/7/t/m maximowiczii Regel)
—AB360796(L/7/t/m maximowiczii Regel)
|-KUB870359(L/7/t/m)
-MK005151(L/7/t/m)
KU159091(L/7/t/m)
KX245538(L/7/t/m asiatic cv.Tiny padhye)
cmmb移动电视
-LN651194(L/7/t/m)
--------------------------LC155795(Nandina donmestica)
-KU697313(P/an?a^o asiatica)
KY923700(Rehmannia glutinosa)
-Z21647(Plantago asiatica)
------------------------------------LC155796(IZ/o/a grypoceras)
63
59
28
55
8?1_\
61L
0.02
图3基于P1AMV t基因核昔酸序列构建的系统进化树
Fig.3Phylogenetic tree of P1AMV isolates based on the nucleotide sequences of their t genes
玻璃纤维滤筒
图4P1AMV CP蛋白的二级结构、亲水性、柔韧性和抗原性预测
快速插头
Fig.4Prediction of secondary structure,hydrophilicity,eexibility and antigenicity of P1AMV CP protein
为制备抗P1AMV CP蛋白的多克隆抗体，将纯化的CP蛋白免疫新西兰大白兔抗血清，通过间接ELISA抗血清效价。，制备的抗血清效价可达到32000（表1），表纯化的CP蛋白具有较好的免疫原性，制的多克隆抗体具备高效价。
2.7Western blot免疫印迹
提取百合和马铃薯叶片总蛋白，经Western blot检测，发现抗体与感染P1AMV的百合样品在期大小处发生特异性反应，而与健康百合样品、分别感染LSV、CM V和LMoV的品，及感染PVX的马铃薯样品反应，表抗够特异性P1AMV CP蛋白，具良好的特异性（图7）
o
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