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试剂配制:
Buffer QBT(1000ml):分别称取NaCl 43.83g,MOPS 10.46g,加入600ml 双蒸水,用NaOH调节pH值为7.0,然后加入150ml 异丙醇,定容至1000ml。
Buffer QC(1000ml):分别称取NaCl 58.44g,MOPS 10.46g,加入600ml 双蒸水,用NaOH调节pH值为7.0,然后加入150ml异丙醇,定容至1000ml。
Buffer QF(1000ml):称取NaCl 73.05g,量取2M Tris-HCl 25ml,加入800ml 双蒸水,用NaOH调节pH值为8.5,然后加入150ml 异丙醇,定容至1000ml。
1M NaOH (400ml ):分子量:40,秤取16g NaOH,溶于400ml 双蒸水中。
2M Tris-HCl (500ml):分子量为121.14,秤取121.14g Tris,溶于400 ml 双蒸水中,用HCl调节pH值为8.0,定容至500ml。
10×TE Buffer:量取1MTris-HCl(pH8.0) 100ml,500mM EDTA(pH8.0) 20ml,加入800ml双蒸水,均匀混合后定容至1L。
Buffer P1 (1000ml):用50ml离心管量取20ml 0.5M的EDTA,然后量取25ml 2M 的Tris-HCl,加入700ml 双蒸水,用HCl调节pH值为8.0,定容至1000ml。全局消息钩子
Buffer P2(1000ml):称取10g SDS,放入1000ml的玻璃瓶中,然后加入750ml 双蒸水,最后加入200 ml 1M的NaOH,混匀,室温放置过夜,使其自溶。 (注:不需要定容,严格按步骤操作)
Buffer P3 (1000ml):秤取294.42g乙酸钾,溶于800ml 双蒸水中,用冰醋酸调节pH值为5.5,定容至1000ml。
配制RNase:
(1) 将RNase粉末溶于10mM的乙酸钾(即Buffer P3),配制成浓度为10mg/ml的溶液。
(2) 将配好的RNase溶液100℃加热10min, 随后冷却至室温。
(3) 用1M 的Tris-HCl调节pH值至7.4,大约需要0.1体积的Tris-HCl。
(4) 分装RNase溶液于1.5ml EP管中,-20人脸识别医疗℃保存。
使用前注意事项:
i. 在提low-copy(低拷贝)质粒时,增加lysis buffer(裂解液)体积可以提高碱性裂解的效率以及DNA的产量。 ii. Buffer P1在使用前加RNase A solution(RNA酶溶液),一瓶Buffer P1加入一小瓶RNase A(用前瞬时离心),终浓度为100ug/ml。
iii. 检测Buffer P2是否有因低温储存而引起的SDS沉淀。如有必要,将SDS在37℃溶解。
iv. Buffer P3在4℃下预冷。
1、 在选择平板上挑选一个单克隆,在含有相应抗性的2—5ml中液体LB培养基初培养:37℃摇床200-300rpm下培养约8h。 (使用的管子或烧瓶至少是培养体积的4倍)
2、 将初培养菌液用选择性LB培养基稀释到1/500到1/1000。
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High-copy plasmid(高拷贝质粒):用100-200ul初培养液接种100ml介质。Low-copy plasmid(低拷贝质粒):用250-500ul初培养液接种500ml。控水系统37℃摇床300rpm下初培养约12-16h。OD600 =4-5,此时培养细胞浓度可达到约3-4×109个/ml。 (使用的烧瓶或容器至少是培养体积的4倍,最好使用锥形瓶摇菌)
3发烟筒、4℃离心机6000g离心15min收集细菌细胞。
(如果想在此步骤停止以后再做,把细胞-20℃冻存)
4、 10mlBuffer P1重悬细菌细胞。
(确保Buffer P1里已经加入RNase A)
(为使细菌完全重悬,用振荡器充分溶解菌液沉淀)
5、 加入10mlBuffer P2,轻轻上下颠倒封盖的管子4-6次彻底混合溶液,室温(15-25℃)下放置5min。
(不要涡旋,因为涡旋能导致基因组DNA机械断裂。裂解液会有粘性。溶解反应不要超过5min。装有Buffer P2的瓶子用后要立即盖紧,以免被空气中的CO2酸化)。
6、 加10ml预冷的Buffer P3,立即轻轻上下颠倒4-6次混匀,冰上放置20min。
(预冷的Buffer P3和冰上放置能促进沉淀。加入Buffer P3后有乳白的物质形成且裂解液粘性减少。沉淀物中含有基因组DNA、蛋白质、细胞残渣) 。
7、 20 min后,6000 g 4℃离心25min。同时,向柱子中加入10ml Buffer QBT,使其全部流过柱子,平衡柱子。 8、 剪一小块纱布,折叠4层,放于柱子上部。将离心后的液体缓慢倒入纱布中,最后挤压纱布使其中的液体全部直接过滤到柱子中,使其充分流过柱子。(如果此步不只1个质粒时,挤压不同质粒的纱布时,一定要换手套,避免污染质粒)。
9、 用2×30mlBuffer QC (wash buffer)洗柱子。
(Buffer QC通过重力流通过柱子。第一次清洗就足够去除大部分质粒DNA沉淀中的污染物。但是,当培养体积较大或者菌种会产生大量的糖类时第二次清洗是必要的)
10nfs5、洗脱质粒:向柱子中加15ml Buffer QF,靠重力作用使其全部通过柱子,收集洗脱液。(注:要收集到一个新的管中。)
11、沉淀质粒:向收集的液体中,加入0.7倍体积(即10.5 ml)异丙醇,轻轻混匀,6000 g 4℃离心25 min。(异丙醇可以充分沉淀质粒,但同时会沉淀很多盐分)
12、清洗质粒:离心后,注意质粒贴壁的方向,应从其侧面倒掉废液。用5ml70%室温保存的乙醇洗涤DNA颗粒,将含有DNA的乙醇转移到1.5ml的EP管中, 6000 g 4℃离心10min,轻轻吸弃废液。(残留的乙醇会影响后续反应中的酶活性)。
13、 将EP管倒扣于吸水纸上,空气干燥5-10min,用适当体积的TE溶解DNA。
14、 柱子回收:
(1)先用自来水冲洗柱子内外;再用蒸馏水和双蒸水冲洗柱子内外。
(2)20ml 1M HCl流过柱子一遍,流完后再加10ml的1 M HCl,使其部分流出,最后剩余7-8ml于柱子中。柱子底部盖上盖子,顶部用封口膜封上,室温放置过夜。(HCl 可充分降解DNA)。
(3)第二天,先让柱子中的HCl全部流尽,然后用双蒸水清洗两遍柱子,再用bufferQBT清洗柱子(6×10ml),最后留适量的buffer QBT于柱子中。