郑文宇1
丁筑红2*刘海2
（1尤溪县食品检验检测中心
福建三明365100
2
贵州大学酿酒与食品工程学院
贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室
贵阳550025）
摘要目的：探讨抗氧化系统与辣椒红素褪变的关系，为防控病理因素导致的辣椒红素损失提供理论依据。
方法：采用外源活性氧·OH 、H 2O 2、O 2
·-以及过氧化物酶（POD ）、过氧化氢酶（CAT ）和脂氧合酶（LOX ）作用辣椒红素，探究其稳定性变化。结果：在外源活性氧条件下辣椒红素不稳定。超氧阴离子（O 2-·）释放源———甲基紫精在低浓度（0.8mmol/L ）作用5h 后，素降解明显，素溶液由红褪变成浅黄，且浓度越高素颜变化越显著（P <0.05）；辣椒红素在过氧化氢（H 2O 2）环境下不稳定，8mmol/L H 2O 2处理5h 后辣椒红素残存率仅52.76%；羟自由基（·OH ）比H 2O 2对辣椒红素降解作用更为显著（P <0.05）。在外源活性氧（H 2O 2）处理的同时添加外源防御酶POD 和CAT ，辣椒红素含量降低不明显，活性氧与防御酶共存体系素褪变较单一活性氧体系缓慢（P >0.05）。LOX 粗酶液单独作用5h 后，素溶液澄清颜褪变明显，且LOX 浓度越高，素的降解程度越明显。作用1～5h ，LOX 处理组素含量明显低于对照组（P <0.05），说明LOX 对素降解有重要影响。结论：辣椒红素褪变与辣椒抗氧化系统有着密切的关系，有效控制辣椒采后病菌感染对保护辣椒素稳定性具有重要意义。关键词抗氧化系统；活性氧；辣椒素；稳定性 文章编号
1009-7848（2014）02-0085-08
辣椒素（Capsicum pigment ）属类胡萝卜素类素，为具有长链共轭结构的脂肪族类素、共轭多烯烃胡萝卜素含氧衍生物，即酮基类胡萝卜素（叶黄素类），是辣椒精深加工的主要的最有价值的
成分[1]。目前，对类胡萝卜素类素的研究大都集中于生物合成、理化稳定性、生产制备及其应用研究方面[2]。辣椒采后干制过程中，常常出现辣椒果肉部分红减褪，呈黄白间杂斑块，俗称“花壳”、“花皮”等现象，严重时干辣椒整果红消褪，呈干燥状黄白，甚至肉质消失呈轻飘透明薄片，完全丧失商品和营养价值[3-4]。对常见果蔬褪变的研究发现，褪变是由于组织内抗氧化酶活性能力下降，活性氧得以积累引发膜脂过氧化，对细胞膜结构伤害，进一步影响呼吸作用，加速植物衰老和颜褪变[5]。有报道[6-7]称，病菌侵染及采后继续危害是导致辣椒“花壳”的主要原因。笔者前期研
究发现，微生物侵染是导致鲜椒自然干制产生“花壳”的根本原因，并分离出导致辣椒采后产生“花壳”现象的主导病原菌。
病原菌感染导致植物发生过敏性反应，产生大量的活性氧（ROS ）[8]。植物体内ROS 积累过多，
ROS 与其清除酶类之间的动态平衡被打破[9]。笔者
前期研究发现，采后辣椒在“花壳”致变菌感染后，与非致变菌侵染辣椒相比，果肉组织产生大量的活性氧，并引起过氧化物酶（POD ）、过氧化氢酶（CAT ）和脂氧合酶（LOX ）的变化。有关活性氧与防御酶对辣椒红素稳定性的影响尚未见报道。本文探讨外源活性氧和防御酶对辣椒红素稳定性影响，为防控病理因素导致辣椒红素损失提供基础理论依据。
1
材料与方法
1.1
材料及处理
辣椒：贵州省贵阳市花溪区本地平板椒品种，
购买后随即运回实验室。选取无机械损伤、霉变、无病虫害、大小均匀、成熟度一致的辣椒作试材。
收稿日期：2013-02-26
基金项目：国家自然科学基金项目（31060228）作者简介：郑文宇，男，1987年出生，硕士通讯作者：丁筑红
Vol．14No．2Feb ．2014
Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
中国食品学报
第14卷
第2期
2014年2月
中国食品学报2014年第2期
辣椒红素（纯度≥98%），贵州五倍子发展公司提供；丙酮（C.R）；甲基紫精（methylviologen），Sigma公司；30%过氧化氢（H2O2），分析纯，重庆川江化学试剂厂；FeSO4·7H2O，分析纯，重庆茂业化学试剂有限公司。
1.2仪器
电子天平，上海奥豪斯公司；TU-1810自动扫描紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。
1.3试验方法
1.3.1吸收光谱的测定[10]取一定量的辣椒红素，用适量丙酮溶解，配成0.05%的素溶液，用TU1810型紫外-可见分光光度计在200~600nm 范围进行波长扫描，读取λmax。
1.3.2粗酶液的制备[11]过氧化物酶（Peroxidase，POD）的制备：称取5g辣椒组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液（含1mmo1PEG，4% PVPP和1%Triton X-100），在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃，12000r/min离心30min，收集上清液即酶提取液，低温保存备用。
过氧化氢酶（Catalase，CAT）的制备：称取5g 辣椒组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液（含5mmol/L DTT和5%PVP），在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃，12000r/min离心30min，收集上清液，即酶提取液。低温保存备用。
脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）的制备：称取5 g辣椒组织于研钵内，加入5.0mL经4℃预冷的提取缓冲液（含1%Triton X-100和4%PVPP），在冰浴条件下研磨匀浆，然后转入离心管，于4℃，12000r/min离心30min，收集上清液，低温保存。
1.3.3活性氧的制备供试超氧阴离子（O2-·）：参照宋凤鸣等[12]的方法，采用甲基紫精作为O2-·释放源。羟自由基（·OH）：依据Fenton reaction反应，以·OH产生系统（Fe2+和H2O2）[13]配制。
1.3.4活性氧及防御酶辣椒红素体外氧化试验
1）配制不同浓度的Fe2+和H2O2溶液（产生·OH），取等体积溶液加至配制好的0.05%辣椒红素溶液中，溶液呈橙红，用丙酮定容10mL，摇匀，测定其在最大吸收波长457nm处的吸光。静置，每隔1h测定吸光度，并与对照组比较，观察颜变化，计算素最后的残存率。
2）配制0，200，400，600，800，1000μmol/L浓度的甲基紫精溶液作为O2-·的释放源。分别取适量加至0.05%辣椒红素溶液中，用丙酮定容10 mL，摇匀，测定其A457。静置，每隔1h测定吸光值，观察其颜。
3）POD、CAT和LOX粗酶液，分别取1.0mL 加入配制好的0.005%辣椒红素溶液中，用丙酮定容10mL，摇匀，在457nm处测定其吸光度。静置，每隔1h测定吸光值，同时观察颜变化。
4）POD、CAT、LOX活性的测定：参照曹建康等[11]的方法。
各项指标均为3次重复测定的平均值。
1.4数据处理
试验结果以x軃±s表示。采用EXCEL表格和PASW Statistics18软件进行统计与分析，用Dun-can’s新复极差法进行多重比较。
2结果与分析
2.1辣椒红素吸收光谱的测定
通过紫外-可见分光光度计在200~600nm范围进行全自动波长扫描，得到辣椒红素吸收光谱图。由图1可知，辣椒红素在波长330~600nm 之间有较强的吸收峰，其中最大吸收波长为457 nm。选择波长457nm作为辣椒红素的吸收波长。
2.2活性氧对辣椒红素的影响
从表1可知，辣椒红素溶液中添加H2O2后，随着反应时间的延长，素吸光值总体呈逐渐减低趋势。在反应1～5h素吸光值均显著低于对照组（P<0.05）。添加的H2O2浓度越高，素含量减少越快。当H2O2处理浓度6～8mmol/L，反应5h时，素损失近半。10mmol/L H2O2已显著氧化分解素，溶液颜变为浅黄（图3）。
羟自由基（·OH）是最有活性的ROS，将H2O2和Fe2+同时加入处理辣椒红素，比单独用H2O2处理时对素有更强的降解作用（P<0.05）。随着Fe2+的浓度增高，降解作用增强，说明·OH表现出对素的强降解性，溶液浅且几乎透明（图3）。当H2O2和Fe2+同时加入且Fe2+浓度较高时，素溶液产生浑浊和红褐沉淀，素的吸光值急剧减少。
86
第14卷第2期190.00210.502
51.50
231.00272.00292.50313.00333.50354.00538.50374.50395.00415.50436.00456.50477.00497.50518.00559.00579.50600.00波长/nm
1.2000.575
-0.050
A b s
209.50
457.00
光谱扫描曲线
一次性拖鞋图1辣椒素的吸收光谱图
Fig.1The absorption spectrum of capsicum pigment
00 1.130±0.012 1.129±0.012 1.129±0.008 1.129±0.009 1.129±0.005 1.128±0.00899.8200.10.959±0.0470.939±0.0100.934±0.0130.926±0.0120.920±0.0140.915±0.01195.5201 1.117±0.015 1.113±0.026 1.108±0.011 1.098±0.005 1.065±0.023 1.054±0.04094.360100.928±0.0260.923±0.0140.916±0.0060.901±0.0060.890±0.0210.882±0.02194.8320 1.111±0.024 1.110±0.033 1.104±0.0400.103±0.004 1.104±0.018 1.091±0.00898.2020.1 1.096±0.010 1.079±0.005 1.056±0.017 1.036±0.037 1.027±0.009
1.002±0.009
91.42210.932±0.0670.796±0.046
三通管接头0.488±0.006
0.304±0.024
红褐沉淀红褐沉淀-2100.477±0.042浑浊
红褐沉淀
红褐沉淀
红褐沉淀
红褐沉淀
-40 1.081±0.033 1.068±0.018 1.056±0.036 1.041±0.033 1.036±0.038 1.013±0.01593.7140.1 1.039±0.0150.987±0.0150.956±0.0450.947±0.0420.931±0.011
0.907±0.014
87.3041 1.016±0.0130.714±0.032
0.465±0.012
0.312±0.031
红褐沉淀红褐沉淀-4100.071±0.009浑浊
红褐沉淀
红褐沉淀
红褐沉淀
红褐沉淀
-60 1.008±0.0270.997±0.0450.975±0.0150.947±0.0070.937±0.0160.915±0.02290.7760.1 1.040±0.008 1.003±0.0070.958±0.0070.909±0.005
0.875±0.026
换面鞋
0.829±0.036
79.71610.879±0.0160.633±0.005
0.435±0.008
浑浊红褐沉淀红褐沉淀-6100.620±0.025红褐沉淀
红褐沉淀
红褐沉淀
红褐沉淀
红褐沉淀
-800.923±0.0420.800±0.0120.771±0.0140.636±0.0560.550±0.0410.487±0.01352.7680.10.844±0.0240.753±0.0270.674±0.009
0.536±0.044
0.428±0.028
0.365±0.019
43.25810.654±0.005
0.353±0.055
红褐沉淀红褐沉淀红褐沉淀红褐沉淀-810红褐沉淀
红褐沉淀
红褐沉淀
红褐沉淀
红褐沉淀
红褐沉淀
-1000.792±0.0180.668±0.0310.525±0.0270.414±0.0190.372±0.0040.354±0.05844.70100.10.765±0.0640.636±0.0130.587±0.073
0.431±0.023
0.369±0.018
0.273±0.035
35.691010.685±0.056
0.263±0.069
红褐沉淀红褐沉淀红褐沉淀红褐沉淀-10
10
红褐沉淀
红褐沉淀
红褐沉淀
红褐沉淀
红褐沉淀
红褐沉淀
-
H 2O 2Fe 2+0h 1h 2h 3h 4h 5h 处理浓度/mmol
·L -1反应时间
素
残存率/%
表1
H 2O 2和·OH 对辣椒红素的影响（x
軈±s ）Table 1
Effects of H 2O 2and
·OH on capsicum pigment （x 軃±s ）活性氧与防御酶对辣椒红素稳定性的影响87
中国食品学报
2014年第2期
植物活性氧迸发中，H 2O 2是最常见且最重要
的表现形式。不同H 2O 2浓度处理下素的降解程度有明显的差异。将H 2O 2加入适量的Fe 2+处理辣椒红素，对素有强的氧化降解作用。由此说明由Fenton 反应从H 2O 2转化生成的·OH ，对辣椒红素有更强的氧化能力。·OH 是ROS 中活性及毒害作用最强的1种，它易与组织中的许多有机物发生氧化反应，导致蛋白质变性和脂过氧化等。有关·OH 对辣椒红素的降解还未见到报道。
甲基紫精可以产生O 2-·[14]
。不同浓度处理对辣
椒红素的影响见图2。O 2-·对辣椒红素的稳定性也有影响。随着反应时间的延长，溶液吸光值呈缓慢下降的趋势，素的损失逐渐增加，颜变浅。甲基紫精处理浓度越大，素吸光值越低。当甲基紫精处理浓度0.8～1mmol/L 时，素的降解速度显著加快，反应5h 后素残存率仅50.19%，颜变为浅黄（图3）。对照组的溶液呈橙红，无褪现象，素几乎无损失。在作用1～5h 时，素溶液吸光值显著低于对照组（P <0.05），不同浓度甲基紫精处理后素吸光值具有显著性差异
（P <0.05）。
外源O 2-·处理对辣椒红素的稳定性影响显著。O 2-·处理浓度越大，素吸光值越低，颜越浅。作用后期辣椒红素减低得比较缓慢，可能与素抗氧化作用有关[15]。
辣椒红素在活性氧体系中不稳定，活性氧浓度越高素残存率越低，其稳定性越差。随着反应时间的延长和活性氧浓度的增加，辣椒红素含量逐渐减少，溶液颜由橙红变为（浅）黄。3种主要活性氧H 2O 2、·OH 和O 2-·对辣椒红素的稳定性产生显著的影响（P <0.05），均会导致素含量下降，而且随着活性氧浓度的增加和处理时间的延长，素稳定性影响增大。其中较高浓度（6～10mmol/L ）的·OH 作用产生的素降解、颜褪变最为明显（图3），低浓度（0.8～1mmol/L ）条件下甲基紫精（O 2-·释放源）的影响次之，说明较高浓度下的O 2-·也对辣椒红素产生强降解作用，不低于·OH 的影响，然而试验后期溶液吸光值下降较为平缓，素较稳定，这可能与素对活性氧有一定的清除作用[1]有关。
吸光值
时间/h
图2不同浓度甲基紫精对辣椒红素的影响Fig.2Effect of different concentrations of methylviologen
手动折弯机on capsicum pigment
反
应前
反应
5h 后
对照甲基紫精处理H 2O 2处理Fe 2++H 2O 2处理
图3不同活性氧处理对辣椒红素的影响
Fig.3Effect of the different ROS treatments
on capsicum pigment
2.3防御酶对辣椒红素的影响POD 和CAT 均是植物组织内分解H 2O 2的重
要标志性酶，也参与类胡萝卜素的降解和酚类物质的氧化[16]。POD 和CAT 粗酶液单独作用辣椒红素试验结果见图4。溶液吸光值变化较小，作用
5h 时，POD 和CAT 试验组素吸光值低于对照
组，素残存率较高，颜稍微变浅，仍为橙红（黄）（图5），说明两种防御酶对素的稳定性有一定的影响，但影响较小。宋朝鹏等[17]研究发现，POD 参与类胡萝卜素的氧化和降解，类胡萝卜素的降解速度远低于叶绿素的降解速度。
88
第14卷第2
期1.000.950.900.850.800.750.700.650.550.50
时间/h
图4POD 和CAT 与辣椒红素含量的变化
Fig.4Change of capsicum pigment content
of POD and CAT
吸光值
对照
POD 处理CAT 处理
反应前
反应5h 后
图5POD 和CAT 对辣椒红素的影响
Fig.5Effect of POD and CAT on capsicum pigment
LOX 粗酶液作用辣椒红素，结果见图6。反
应过程中LOX 对素含量的影响很大，LOX 浓度越高，素的降解越多。LOX 粗酶液作用5h 后素含量残存率仅为44.02%，溶液颜变得澄清（图7）。LOX 粗酶液稀释2倍，作用5h 后的素残存率66.17%，素溶液颜变为浅黄（图7）。作用1～5h ，LOX 处理后的素含量均显著低于对照组（P <0.05），说明LOX 对素降解有重要影响。
试验结果表明LOX 对辣椒红素的降解起
关键作用。LOX 活性变化与植物成熟衰老以及颜等品质的变化密切相关。朱金峰等[18]对烟叶的研
究表明，烟叶在生长前期素含量较高，后期降解较为充分，同时烟叶成熟前期LOX 保持较低的酶活性，而后期保持较高的活性，对充分降解素有利。文献[19]表明，LOX 是类胡萝卜素降解的关键酶，LOX 活性对类胡萝卜素含量的影响很大，其含量变化与LOX 活性呈正相关；同时LOX 活性对叶绿素含量也有很大的影响。宋朝鹏等[17]报道
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LOX 是导致类胡萝卜素氧化和降解酶之一。
1
磷酸氧钛钾2345
时间/h
图6LOX 与辣椒红素含量的变化
Fig.6Change of capsicum pigment content of LOX
吸光值
对照LOX 稀释2倍处理LOX 处理
反应前
反应5h 后
图7LOX 对辣椒红素的影响
Fig.7Effect of LOX on capsicum pigment
2.4活性氧与防御酶体系对辣椒红素的影响文献[20]报道，在氧化体系中，类胡萝卜素类
素分子发团的共轭多烯链可直接与过氧化自
由基或类似自由基作用，共轭链失去电子形成阳离子自由基（Car ·+）；也可被自由基氧化成加合自由基[R-Car]·，加合自由基或经双分子衰变或经加
活性氧与防御酶对辣椒红素稳定性的影响89
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