Development of a Scale-Down Model of hydrodynamic stress to study the performance of an industrial CHO cell line under simulated production scale bioreactor conditions
摘要：
本研究的目的是开发一种大规模生产生物反应器中流体剪切力的缩小模型，以便在模拟的生产条件下研究CHO细胞系的性能。在2L生物反应中制造多种水平的流体剪切力以模仿大规模搅拌釜式生物反应器不同部位的流体剪切力。 总体来说，被检测的细胞在面对流体剪切力时具有较高的稳定性。然而，当流体剪切力升高至与平均能量耗散率(ε)时，即等于0.4W/kg，特定单克隆抗体的产量q mab、相比于ε等于0.01W/kg降低了25%。为了模拟生产规模生物反应器中细胞反复在高速运转的叶轮中通过，使能量耗散率在0.01和0.4W/kg间周期性震荡，q mab的下降更为明显，达到30%。除去这些影响之外，没有观察到代谢物消耗或副产物形成方面的影响。此外，我们认为考虑到实验误差，产品质量不受ε的影响。采用基因芯片分析转录组，在分子水平研究细胞产量的下降。结果显示当培养时采用较高的ε时，转录组相关的DNA损伤和修复机制会上调。 1.简介
中国仓鼠卵巢细胞衍生的细胞系是生产性重组蛋白的主要工业机器。目前采用经典的转染的方法制造大量不同的细胞系以及相同细胞系间的不同克隆，在生产规模条件下预测新细胞系的性能是有难度的。初始克隆的筛选通常采用较小体积轨道公转动摇系统，在这样的系统中没有搅拌和通气。相反的，具有喷气装置的生产搅拌釜式反应器(STRs)是工业细胞培养技术最常采用的培养器皿。大规模生产时同时需要搅拌和喷气装置，以为细胞的生长和生产提供必要的氧气和营养物质，然而他们也是流体剪切力的来源，流体剪切力能够导致细胞损伤或影响细胞的性能。因此，在工艺开发阶段如何选择一个适合生产环境的细胞仍是一个未解的难题。
通常采用能量耗散率(ε)来量化流体剪切力，一个描述动能转化为热能的数值。能量耗散率(ε)或每单位体积的动力输入(P/V)常用作工业细胞培养工艺中叶轮搅拌速率的放大或缩小的相似标准。
研究证实，搅拌釜式生物反应器中的能量耗散率是不均匀的。局部ε值严重取决于器皿中的位置。根据局部能量耗散率和平均能量耗散率的比值ε/(ε)，研究者建立了多种方法用于研究搅拌器皿中湍流的异质性，其中直接测量方法包括粒子图像测速(PIV)和激光多普勒测速仪(LDA)，基于某些剪切力敏感的模型系统的间接测量法。对于单个涡轮桨，在叶轮排出气流在20~60之间时，ε/(ε)取最大值。
对于斜叶片涡轮机，该范围稍微降低至20~40。
除了搅拌之外，通气产生的流体剪切力已经被证明对细胞培养是不利的。当气泡举并、解体或炸裂时
巴特沃斯滤波器会产生高局部ε值。泡沫破裂时的能量耗散取决于气泡的大小，气泡越小能量耗散越大。这提示在大规模生物反应器中因为气泡的体积较大，气泡破裂引起的细胞损伤远小于小规模生物反应器，大规模生物反应器的气泡一般在厘米级别，而小规模生物反应器的气泡在毫米级别。
由于细胞培养工艺中通气是不可避免的，特别是大规模细胞培养。血清和普郎尼克(PF-68)等剪切力保护剂被引入并进行了较为完整的研究。尽管他们的剪切力保护机制仍未完全清楚，由于其具有高效的剪切力保护作用，在工业细胞培养中使用广泛。考虑到血清可能会引起安全问题，所以PF-68更为常用。Ma等研究显示PF-68的浓度为1g/L或更高浓度时，附着在上升气泡的细胞数目大大减少，因而细胞上升和破裂产生的流体剪切力的影响被最小化。
据报道剪切力对细胞的影响包括直接致死事件、致命的细胞反应以及代谢变化引起的亚致命反应。剪切力的阈值取决于被评价细胞已经评价的方法；也就是剪切力设备的水流条件。在悬浮CHO细胞培养中尽在能量耗散率ε在103~105W/kg范围内观察到细胞坏死。与此相反，流体剪切力引起的细胞凋亡反应会导致不可逆的细胞死亡。Mollet等的研究发现ε值在102W/kg时便能引发细胞凋亡。此外，Godoy-Silva等的研究显示工业CHO细胞暴露于ε=60W/kg的条件时时便能引起亚致死反应，尽管这一细胞系的致死ε值为6.4×103W/kg。特別是可以观察到抗体的糖基化模式发生改变，糖基化是是性抗体的一个重要指标。由于这一反应的亚致死性质，我们有理由认为这涉及了基因的表达调控。因此，可以使用基因芯片检测剪切力反应的机制以及基因表型关系。
本研究的目的是建立生产规模生物反应器的缩小模型，并采用缩小模型测验在不同水平的流体剪切力下新细胞系的性能及耐用性，流体剪切力的水平与生产规模生物反应器中的剪切力相对应。对已经建立的CHO单克隆抗体的补料批式培养工艺进行分析以获得针对新细胞系的缩小模型。采用2L生物反应器作为单器皿缩小模型，在不同的搅拌速率下进行操作。采用搅拌速度周期性变化的方法模拟大规模生物反应器中不同位置的局部能量耗散率ε。局部能量耗散率ε来自于理论分析及文献报道。分析细胞生长及代谢，检测产品质量及基因表达水平，从而表征细胞的反应。
2. 材料和方法
2.1 细胞系及培养工艺
本研究采用中国仓鼠卵巢细胞衍生的细胞系，经过无血清培养基驯化后进行悬浮培养。采用经典的方法稳定转染细胞使其能偶生产性人克隆抗体。
青铜旋塞阀细胞从细胞库中复苏后在摇瓶中扩增，采用的培养基为化学坚定型培养基。细胞扩增至少进行4次传代。反应器的接种密度为0.5±0.1×106cells/mL，在化学鉴定型培养基中直接加入适当的数量的种子液。
2.2 生物反应器设置
桑叶采摘器
本研究采用配有DO、pH和温度电极以及两个桨叶的玻璃生物反应器。反应器没有挡板，然而多条管线及电极应该能够提供足够的阻力。通气采用穿孔管分布器。采用固定流速的空气以及按需供应的氧气进行溶氧控制；采用通入二氧化碳和添加氢氧化钠的方法控制pH，如果需要，可以添加消泡剂C溶液以降低气泡的产生。所有的在线数据和离线数据都存入工艺信息管理系统(PIMS)。
为了量化向反应器中输入的动能，采用当前搅拌器引擎的电流与电压的乘积计算净功率，在填满和空的反应器中设置不同的搅拌速率然后测定电压与电流值。获得的功率值将用于评价缩小模型器皿的平均能量耗散率(ε)lab、输入比功率P/V、以及相应的功率数。我们用局部能量耗散率εprod代表生产规模生物反应器中不同部位的能量耗散率，为了研究局部能量耗散率εprod的影响，通过调节2L生物反应器的转速使得εlab=εprod。所有流体剪切力实验的条件总结如表1，选择以上条件模拟生产规模生物反应器中的低湍流区、平均液相主体以及叶轮排出流。实验培养总是与实验室特定的标准培养条件保持可比性。对于某些极端条件，生产规模的叶尖速度，在本研究中该速度大约是2m/s。最后，为了模拟细胞反复暴露于大规模生物反应器中不同部位的水流条件，也就是接近搅拌釜的剧烈震荡以及液相主体的平均湍流，细胞短时间内暴露于高转速后常时间处于低转速。采用一段较短的卢库卢斯步骤序列按照预期的频率调节反应器的搅拌速率。
2.3 离线检测
样品经台盼蓝染后采用全自动细胞计数仪检测细胞密度及细胞活率。离线pH值、溶氧、pCO2、营养物质(葡萄糖、谷氨酰胺)以及基础代谢产物浓度(乳酸、谷氨酸、氨)等通过Bioprofiles 400生化分析仪进行检测。抗体浓度、氨基酸浓度通过标准HPLC进行检测。采用分子筛层析、阳离子交换层析、糖型分析等方法分析产品的质量。通过以下公式估算新陈代谢率，底物浓度比(△c j)的变化、用补料体积和取样体积校正，两次连续测量间活细胞密度的平均值(VCD)△t。
qi=△cj/(VCD×△t) [pmol.·cell-1·d-1]
2.4 生物信息流
应用包括CHO细胞系所有已知的多聚腺苷酸转录的CHO特异性基因芯片。在培养过程中预先确定的培养阶段进行取样，也就是指数生长期、平台期以及后期生产期。将含有107细胞数的培养液转移至不含RNA酶的离心管中进行离心，将细胞置于干冰中进行快速冷冻。根据芯片的标准方案进行芯片处理，采用
圆机罗纹
Genedata Expressionist处理实验数据。，对所有的流体剪切力水平进行单因素方差分析。采用Metacore数据库分析基因的不同表达水平并将基因与基因的功能连接起来。
3. 结果和讨论
3.1 按比例缩小模型表征
列举一个生物反应器流体力学表征的例子，用酚酞颜的改变测量混合时间，以代表平均能量耗散率，即εlab。实验中可以看出即使平均能量耗散率达到0.01W/kg，检测到的混合时间低于10s，表明系统中没有不均匀性，除了与流体剪切力之外。与本文相关的补充材料可以在网上到。
2L生物反应器在湍流状态下测得的功率P0约为4.8。根据Nienow等报道，当叶轮之间的距离是叶轮直径的1.6倍时，单个叶轮的功率可以估算为检测到的双叶轮双叶轮的1/2，因此单叶轮的功率为2.4。这一数值与Zhu等测定的相似叶轮的数据具有很好的契合度。更过关于这类反应器中流体力学的表征也有很多报道。
基于以上发现，可以在2L生物反应器中调节εlab模拟大规模生物反应器中的某些部分，使用局部能量耗散率。尤其是采用εlab/εprod=1模拟湍流中心，εlab/εprod=0.1模拟低湍流中心。为了估算叶轮排出流中心的局部ε，首先考虑检测装备有叶片叶轮的小规模搅拌的生物反应器的实验数据。根据以上检测εmax和ε的最大比值可以达到40，也就是当εprod等于0.01W/kg时，εmax的值会等于0.4W/kg。然而，据Wernersson等报道，当装备涡轮桨叶的起名的体积为0.6~22m3时，εmax 对着Re impeller的升高而升高。考虑到这一点，采用均匀各向同性乱流近似的方法估算生产规模反应器的εmax，εmax=N3D2impeller。开率2L和13.5m3生物反应器中的叶轮直径和操作条件，我们可以发现，大规模
反应器中排出流中心区域的εmax 约是2L反应器的10倍，达到4W/kg。因为我们的目标是在培养过程中提供震荡的ε条件，为了确保每一个细胞都暴露于ε值足够高的环境中，我们调整转速使得εlab的值等于0.4W/kg，此时εlab/εprod=40。此外，某些极端条件下会将试验的条件调至εlab/εprod=100，测试直接将生产规模反应器的叶轮尖端速度按比例缩小的可行性，大概是2m/s。平行于上述条件，也对2L反应器的历史标准操作条件进行检测，相应的εlab/εprod=6。2L生物反应器的搅拌速率及相应的εlab值总结如表一。当目前为止讨论的实验都是在恒定的εlab条件下进行的。模拟假定细胞会持续在特定大规模反应器中完成整个培养。
另一方面，为了模拟大规模生物反应器培养过程中细胞的旅程，改变εlab进行试验，是的εlab/εprod的比值在1~40间来回变动，如表1。据Palomares等报道，细胞先后经过叶轮附近的高强度区的平均周期应该等于被模拟大规模生物反应
器的循环时间t C。据Nienow等报道，tC可以近似为整体混合时间的1/5，而混
合时间可以用过实验测得。本文中考虑的大规模生物反应器，装备了两个直径0.7m的大象耳朵叶轮，工作体积为13.5m3，转速为50rpm。总体混合时间为
180s(95%同质性标准)。采用这一数值计算相应的循环时间tC，引起细胞暴露于
高ε的频率是36s。
为了与大规模生物反应器中的细胞暴露时间相匹配，细胞在叶轮附近的叶轮
排流区的停留时间可以通过叶轮产生的叶轮容积与流量的比值Q(= Fl ND3imp)。
Simmons等测得的象耳朵叶轮的流速Fl等于0.87，因此相应的保留时间接近2S。
考虑到搅拌速率变化所需要的时间(1s左右)，在缩小模型中细胞暴露于剪切力条
件的整体时间是3s。
值得注意的是，所有实验条件中的溶氧水平，包括搅拌速率震荡在内，溶氧
在设定点上下偏移10%，表明在这些实验条件下溶氧设置点可以保持不变。
硬币组合3.2 培养结果
慢性流体剪切力对细胞生长的影响如图1a所示，据报道活细胞密度(VCD)为
细胞培养时间的函数。为了补偿批间差异，采用标准操作条件下获得的最大活细
胞密度对各批的活细胞密度进行标准化，见表1.从表中可以看出，在相当不同的
红外线烘干εlab条件下测得的活细胞密度随时间的变化规律具有很好的可比性，εlab的取值范
围为0.01~1.015W/kg。在1.015W/kg时对应于的生产规模反应器的叶尖速度和ε/εprod的比值为100，可以观察到形成的涡流将泡沫带入液体并导致更多的气泡lab
产生。研究已证明求强烈搅拌引起的气泡运动会降低细胞培养的活细胞密度。然
而，图1a中显示在本研究中搅拌不是真正的原因，因为活细胞密度的时间演化
与标准条件下所得数据具有可比性。这些发现与已发表的研究成果不太相符，即
使采用工业CHO细胞系，结果显示提高流体剪切力会降低活细胞密度。以上结
果强调了本研采用的细胞系是耐受强搅拌剪切力的，即使是与其他的工业细胞系
相比。
与恒定εlab条件下的实验结果相比，当经历相同的增长行为时，在震荡条件
下测得的活细胞密度显示出在培养的前六天时间内较低的细胞生长率，而培养后
期的会达到更高的细胞密度，如图1b所示。
值得注意的是，以恒定的εlab=0.001W/kg进行培养，模拟大规模生物反应器
中εlab/εprod=0.1时的低湍流区，培养过程中出现细胞结团，结果表明在大型生物反
应器的滞留区时间的延长可能会导致同样的不希望出现的现象。因此这些条件下
培养的活细胞密度与其他条件下的培养没有可比性。分别由于细胞结团及泡沫问
题，在0.001W/kg和1.015W/kg条件下培养的发酵液未进行进一步的分析。
可以从以往的文献报道中发现哺乳动物细胞压力的提升会导致细胞代谢的
能量需求增加，这这些情况下如葡萄糖和谷氨酰胺。为了评价流体剪切力对细胞代谢的影响，我们对主要营养物质的消耗及代谢产物的产生进行了研究。图2.显示了特定谷氨酰胺和葡萄糖的消耗速率以及特定乳酸和氨的生成速率与培养时间的函数关系。
从图中可以看到，在培养初期稳定运动期间，qGlucose and qGlutamine均减少，在培养后期分别达到1 and 0.2 pmol cell−1 d−1。不同的能量耗散率间，恒定耗散率和震荡耗散率间均未观察到明显差异，在离线分析中也未观察到不同的培养间出现其它的氨基酸限制(数据未显示)。
在图2c.中可以看到在培养的头四天会产生乳酸，在这之后热算的代谢发生改变，乳酸逐渐下号直至差不多在第十天耗尽。氨的生成速率在第5~6天将至最少，即到达最大细胞密度时，然后在培养的衰退期增长，如图2d所示。
以上结果并未表明，能量耗散率会改变细胞的代谢，能量代谢的限制或产物过度形成而产生的抑制作用。所有的代谢速率进程均完全与应用的εlab无关。
图3.列举了不同条件下的单克隆抗体的单位生产率q mAB。在高流体剪切力条件下单位生产率轻微下降。在最大εlab=0.4W/kg的条件下时q mAB下降25%。尽管在震荡实验中εlab=0.4W/kg进占总体培养时间的10%，同样引起q mAB下降30%。这表明搅拌釜式生物反应器中重复出现的εlab变化会熬制单位生产率的下降。
这里的关键点是确定流体剪切力水平是否会对抗体的质量产生影响，采用分子筛谱、阳离子交换谱及糖型分析等方法分析产品质量。发现所有检测的样品的产品质量差异均很小，差异接近检出限。结果表明采用不同的流体剪切力不影响产品质量。然而需要提醒的是本研究获得的数据显示糖基化模式存在一定的趋势，与Godoy-Silva等报道的相似，糖基化亚型会随着流体剪切力的提高而提高。如图4，列举了不同能量耗散率εlab培养条件下的糖型的变化。误差条代表一个标准偏差，基于标准条件下的重复数据，即εlab=0.06W/kg。条形代表了具体实验与标准条件的差异。bG0亚型代表没有半乳糖结
构，而bG1和bG2分别代表含有1个和2个末端半乳糖。这三种亚型通常占总产品的90%。高甘露糖型或其它亚型呈现出较小的含量，接近分析方法的检测限，这解释了图4中这些条形的高变异性。可以观察到高能量耗散率或震荡能量耗散率的抗体呈现更高的半乳糖化趋势。半乳糖含量不作为药物安全性的风险点，但可能会影响性抗体的活性。因此在工艺放大过程中应密切监控半乳糖化。
图5列举了生物反应器中不同的能量耗散率水平以及相应流体剪切力产生的致命和半致命反应。当比较平均能量耗散率0.4W/kg的阈值时，我们的数据显示，单抗产量的降低代替，下降至与Godoy-Silva等测得的60W/kg的相同。可以看到我们的值低得多，大约有150因子。必须提到的是GodoySilva等的研究
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议