实验一 产酶微生物的分离、纯化与选育
酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。 2. 蛋白酶产生菌的分离与纯化
2.1 实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化。
2.2 实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。
2.3 实验仪器与材料 土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。 2.4 实验方法与步骤
2.4.1 分离
1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液；
2）取1：10土壤悬液5ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌；
3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h；
4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染，判断是否为芽孢杆菌。
2.4.2 筛选 1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基，再点接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养24-48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径。2）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。
2.5 实验结果
在含酪蛋白的平板上，产蛋白酶的芽孢杆菌可形成蛋白质水解圈。自然界中分离的微生物各菌株间产蛋白酶活力有很大差异，有些芽孢杆菌酶活力超过4000 U/mL。
1）描述你所分离的蛋白酶产生菌的菌落特征和个体形态特征；2）报告你所分离的蛋白酶产生菌的初筛（水解圈与菌苔直径的比值）结果。
2.6 注意事项 1）土壤悬液加热处理的温度和时间应准确控制；2）点接含酪蛋白的平板时，接种量及接种面积要基本相同。
2.7 分析与讨论 在酪蛋白平板上水解圈与菌落直径比值大的菌落，其蛋白酶活力不一定大，因此，对初筛选出的水解圈与菌落直径比值大的菌落要进行发酵培养，进一步对发酵
液进行酶活力测定。
2.8 思考题 1）对所筛选的菌株如何进一步提高酶活力？请写出设想和方案；2）蛋白酶有哪些方面的应用。
参考书目
[1] 扬文博，微生物学实验.北京:化学工业出版社，2004.
[2]黄秀梨、辛明秀主编，微生物学实验指导，高等教育出版社，2008年.
附：相关培养基
1．酪素培养基：牛肉膏0.3g、NaCl 0.5g，酪素 1.0g，琼脂 2.0g，水100mL， pH 7.6-8.0。配制方法：称取酪素1g，先用少量2%NaOH润湿，玻璃棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH值，灭菌备用。
2．产蛋白酶发酵培养基：玉米粉 6.0g，豆饼粉 4.0g，Na2HPO4 0.4g，KH2PO4 0.03g，
Na2CO3 0.1g，自来水100 mL，pH 9.0(灭菌前)。配制方法：称取玉米粉3g、豆饼粉2g，置于洁净干燥的500mL锥形瓶中，轻轻摇动，使物料混匀。按上述配方用自来水配置无机盐溶液50mL，调pH值，倒入装有物料的锥形瓶中，混匀，0.1MPa压力，灭菌30min。
3．淀粉培养基：牛肉膏0.5 g，可溶性淀粉0.2 g，蛋白胨1.0 g，琼脂 2.0 g，NaCl 0.5 g，蒸馏水100 ml，pH值 7.2-7.4。配制方法：先用少量蒸馏水将可溶性淀粉在沸水浴中煮融，至淀粉液透明，补足水量，将其他成分溶入，调pH值， 0.01 MPa压力，灭菌30 min。
4．产淀粉酶发酵培养基：玉米粉 8.0 g，蛋白胨 0.5 g，豆饼粉 4.0 g，K2HPO4 0.5 g，(NH4)2SO4 0.4 g，蒸馏水100 ml，自然pH，0.05 MPa压力，灭菌30min。
精密电阻箱4. 产酶微生物菌种的选育
生物的遗传信息的改变是通过基因突变、基因重组和基因转移来进行的。基因突变，又称点突变（point mutation），包括自发突变和诱发突变，前者是未经人为施加诱变剂处理而发生的突变，后者是经人为施加诱变剂处理而获得的突变。两种突变都是由于一个或几个
碱基的增加、缺失或置换而引起的，因此本质相同，不同的只是诱发突变的频率比自发突变的频率要高得多。这一部分的实验是以紫外线和亚硝基胍为例介绍了物理因素和化学因素对微生物的诱变作用。本实验中，学生将筛选出的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶的产生菌株作为出发菌株通过紫外线和亚硝基胍即物理因素和化学因素对微生物的诱变作用，对以上菌株进行选育工作。特以淀粉酶产生菌株作为出发菌株，经过紫外线和亚硝基胍的诱变作用，根据透明圈直径与菌落直径的比值，可初步确定淀粉酶的高产菌株为例来介绍本实验内容。
4.1 实验目的 通过实验观察紫外线和亚硝基胍等理化因素对微生物的诱变效应，并掌握基本方法。
4.2 实验原理
基因突变可分为自发突变和诱发突变。许多物理因素、化学因素和生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂。
紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链
上两个相邻的胸腺嘧啶间形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此，为了避免光复活，用紫外线照射处理以及处理后的操作应在红光下进行，并且照射处理后的微生物放在暗处培养。
亚硝基胍（NTG，N-甲基- N-硝基-商场柜台制作亚硝基胍）是一种有效的诱变剂，在低致死率的情况下也有很强的诱变作用，故有超诱变剂之称。它的主要作用是引起DNA链中GC-AT的转换。亚硝基胍也是一种致癌因子，在操作中要特别小心，切勿与皮肤直接接触。凡有亚硝基胍的器皿，都要用1mol/LNaOH溶液浸泡，使残余的亚硝基胍分解破坏，然后清洗。
本实验分别以紫外线和亚硝基胍作为单因子诱变剂处理产生淀粉酶的菌株，根据试验菌诱变后在淀粉酶培养基上透明圈直径的大小来指示诱变效应。一般来说，透明圈越大，淀粉酶活性越强。
4.3 实验仪器与材料 筛选出的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶的产生菌株、淀粉培养基、pctiLB液体培养基、溶液和试剂、亚硝基胍、碘液、无菌生理盐水、无菌水试管等；1 mL无菌吸管、玻璃涂棒、血细胞计数板、显微镜、紫外线等（15W）、磁力搅拌器、台式离心机、震荡
混合器等。
4.4 实验方法与步骤
4.4.1 紫外线对出发菌株的诱变效应
1）菌悬液的制备：年轻的MM2① 取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面4-5支，用10 ml 无菌生理盐水将菌苔洗下，倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。② 将上述菌液离心（3000 r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次，最后制成菌悬液。③ 用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。
2）平板制作：将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板27套，凝固后待用。
3）紫外线处理：① 将紫外线灯开关打开，预热约20分钟。② 取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3ml，并放入一根无菌搅拌棒于平皿中。③ 将上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟和微型拉曼光谱仪3分钟。盖上皿盖，关闭紫外灯。
4）稀释：在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。
5）涂平板：取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。
6）培养：将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。
7）计数：将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。
8）观察诱变效应：将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5-6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。
4.4.2 亚硝基胍对试验菌的诱变效应
1）菌悬液的制备：① 将试验菌斜面菌种挑取一环接种到含5 ml淀粉培养液的试管中，置37℃震荡培养过夜。② 取0.25ml过夜培养液至另一支含5 ml淀粉培养液的试管中，置37℃震荡培养6-7h。
2）平板制作：将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板10套，凝固后待用。
3）涂平板：取0.2 ml上述菌液放到一套淀粉培养基平板上，用无菌玻璃涂棒将菌液均匀地涂满整个平板表面。
4）诱变：① 在上述平板稍靠边的一个位点上放少许亚硝基胍结晶，然后将平板倒置于37℃恒温箱中培养24h。② 在放亚硝基胍的位置周围将出现抑菌圈。
5）增殖培养：① 挑取紧靠抑菌圈外侧的少许菌苔到盛有20mlLB液体培养基的三角瓶中，摇匀，制成处理后菌悬液，同时挑取远离抑菌圈的少许菌苔到另一盛有20mlLB液体培养基的三角瓶中，摇匀，制成对照菌悬液。② 将上述2只三角烧瓶置于37℃震荡培养过夜。
6）涂布平板：分别取上述两种培养过夜的菌悬液0.1ml涂布淀粉培养基平板。处理后菌悬液涂布6套平板，对照菌悬液涂布3套平板。涂布后的平板，置37℃恒温箱中培养48h。实际操作中可根据两种菌液的浓度适当地用无菌生理盐水稀释。注意每套平板背面作好标记，以区别经处理的和对照。
蚀刻因子7）观察诱变效应：分别向菌落数在5-6个的处理后涂布的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。
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