细胞总蛋白的提取及裂解液一.悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS(0.01M)中,加入饱和浓度一抗(1/10)或(10ug/ml)4℃15-30min后,短暂离心4000 转×3分,用PBS 0.4-0.5ml重悬(室温),加入饱和浓度二抗(1/100)或 (20ug/ml),迅速置于37℃水浴中2-5分后(迅速加入终止液0.5ml(冷pbs中含有400uM Na3VO4,5mM EDTA,10mM NaF)),离心4000 转×3分,弃上清,置于冰浴中,加入裂解液热转印墨水配方
0.2-0.3ml(裂解浓度108/ml?)吸管轻轻混匀,冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml的PMSF储存液,冰点孵育30分钟。4度离心15000g 20min。上清液即为全部细胞溶解成分。二.裂解缓冲液:50mM Tris-HCl pH7.6 或20mM Hepes pH7.4150-300mM NaCl1%(w/w)NP-40 (0.5%Triton-X100) 5mM EDTA(现加1ml加10ul)
临用前加入蛋白酶抑制剂:
Na3VO4
钒酸钠 1mM (75mM—13.3ul/ml)
(用0.2mol/L储存液配制)
PMSF苯甲酰氟 1mM (10mg/ml PMSF 用量:10ul/ml)
或10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor (加10-20ul)
Aprotinin 抑肽酶 10ug/ml(10ul/ml钼铋系催化剂生产厂家)
(Leupeptin 亮肽素 10ug/ml 未加) Western blotting
三.给你介绍一个裂解液:
50mM Tris-HCl (PH8.0)缓冲液,含:
NaCl 150mM
叠氮钠 0.02%
SDS 0.1%
NP-40 1%
PMSF 100ug/ml(使用前临时加入)上彩(10mg/ml PMSF 用量:10ul/ml)
尽量用少的裂解液裂解细胞,取上清电泳,最好用6xSDS 上样buffer。
四.我的样品蛋白是这样制备的:
1.将与腺病毒转染液共培养24小时的细胞消化下来
2.离心收集细胞
3.向离心管里加入40微升1×PBS 缓冲液,随后再加入40微升2×Lamily
buffer (由tris碱和SDS 组成)裂解细胞
感应门制作4.将细胞裂解液放入沸水中加热五分钟,放冷后离心.
5.测定蛋白浓度,加样电泳
我所说的前沿有蛋白是指胶的底端,不是指加样孔下面有蛋白.胶的浓度应该没
问题。
五.碧云天公司技术支持
Western 及IP 细胞裂解液的主要成分为20mM Tris(pH 7.5)diy电子显微镜,150mM NaCl,1%
Triton X-100,以及焦磷酸钠, β-glycerophosphate,EDTA,Na3VO4,leupeptin
等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解,并维持原有的蛋白间相互作用。(-20
℃保存,一年有效。)如果是贴壁细胞,按照6孔板每孔加入100微升裂解液的比例(即细胞培养液量的1/20)加入裂解液。多孔管
六.军科院技术支持裂解液(50mmol/L Tris?HCl pH8.0,150mmol/L NaCl,1%TritonX-100,100ug/mlPMSF):1mol/L Tris?HCl(pH8.0) 2.5mlNaCl 0.438gTritonX-100 0.5ml蒸馏水至 50ml混匀后, 4℃保存。使用时,加入PMSF 至终浓度为100ug/ml(0.87ml 裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl)。七.操作方法:蛋白样品制备:(1) 单层贴壁细胞总蛋白的提取: 1、倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置
一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。
2、每瓶细胞加 3ml 4 度预冷的PBS(0.01M pH7.2~7.3)。平放轻轻摇动1min
洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将
PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。
3、按 1ml 裂解液加10 ul PMSF(100mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无
结晶时才可与裂解液混合。)
4、每瓶细胞加400 ul 含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂
解培养瓶要经常来回摇动。
5、裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用
将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)
6、于 4度下12000rpm 离心5min。(提前开离心机预冷)
7、将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20 度保存。