(Jin Quan-Wen Lab at XMU)
一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备:
第一天:
1. 用头或接种环挑取单克隆菌落,接种入盛有5ml LB液体培养基的培养管中,可以准备两管。37 C,220rpm,培养过夜(14-16个小时)。
2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)和几个50ml离心管,以备第二天离心收集细菌用。 3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升),保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细菌细胞用。
第二天:
1. 取2-5ml过夜培养液,接入500ml LB (或2XTY)液体培养基中, 控制起始OD600 = 0,03-0,05。 37 C,220rpm远控多叶排烟口,振摇2-4小时,每半小时测一次OD,当OD值达到0.4时,停止培养。
2. 将菌液在冰上预冷30分钟。同时,开启离心机,预冷至4 C。 3. 随后将菌液分装到250ml或500ml 预冷的离心瓶中,4 C,4000rpm离心15分钟。
4. 弃上清液,先用少量(如20-50ml)灭菌的冰水重悬沉淀的细胞团,然后加水稀释至离心瓶的2/3体积,充分悬起细胞(可以用手握住瓶体上部震荡!)。4 C,q1se4000rpm离心15分钟。
5. 弃上清液,加少量灭菌水,重悬菌体,再加水至所有细胞悬浮约500ml冰水中。4 C,4000rpm,离心15分钟。
6. 弃上清,往离心管中加入少量10%甘油(灭菌,预冷),重悬菌体,再加10%甘油至终体积约为20ml。 4 C, 4000rpm, 离心10min。
7. 小心弃去上清(沉淀可能会很松散!),加入2ml 10%甘油(灭菌,预冷)重悬浮细胞。
8. 将悬浮菌液以200ul/管分装于1.5ml的Ep离心管中,在液氮中快速冷冻后,于-70 C冰箱中保存。
9. 检测转化效率:取100 l新鲜制备的感受态细胞,加入0.01ng已知浓度的plasmid DNA,电转化后,将重悬在1ml SOC培养液并复苏的细胞分别取10 l (1%)和100 l (10%)涂板,估测转化效率。
* Optimal efficiency is ca. 1X108 cfu/µg DNA for general cloning.
** For library transformation, efficiency with ca. 1X109 cfu/µg DNA is required.
感受态细胞制备简要流程:
收集细胞 冰水冲洗细胞2次风刀干燥机 10%甘油冲洗细胞1次 重悬细胞在10%甘油 分装
二、电转化 [连接产物、纯化质粒或质粒文库]:
1.从-80 C冰箱中取出感受态细胞,置于冰上解冻。
3.将解冻的感受态细胞按照40~100ul/管转移至预冷的1.5ml的离心管中,小心混匀,冰
上放置。
4.取1-2 µl 纯化的质粒或克隆连接产物于1.5ml的离心管中,冰上放置10min。[加入的DNA体积过大时,其中的盐会造成电击时产生电火花!]
5.打开电转仪[Bio-Rad Gene Pulser System],调至Manual,调节参数设置为25 µF, 200 OHMs, 电压为2.0 kV [这些参数设置可以根据经验略作调整]。
6.将此混合物转移至已预冷的电击杯中,轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电极杯的底部。用吸水纸吸干电击杯外壁的冰水。
7.将电击杯推入电转化仪,按一下pulse键,听到蜂鸣声后,向电击杯中迅速加入2X 500 l的SOC液体培养基,重悬细胞后,转移到1.5ml的离心管中。
8.37 C,220-250rpm复苏1小时。
9.离心,涂板,置于37 C,过夜培养,次日查看转化结果。
三、电击杯的清洗和保存:
1. 用清水将用过的电击杯稍一下,向电击杯中加入75%酒精冲洗。
2.弃去酒精,再用蒸馏水冲洗2~3遍,然后用1ml的吸取超纯水反复吹打电击杯10次以上。
3.加入无水乙醇1-2ml于电击杯中,浸泡5分钟。
4.弃去无水乙醇,将电击杯倒置于吸水纸上让乙醇充分挥发。
5.将清洗并干燥好的电击杯加上盖子,存放备用。
几种可以选用的细菌培养基:
| 200ml | 500ml | 1000ml |
LB | 1 g yeast extract 2 g tryptone (or peptone) 2 g NaCl | 2.5 g yeast extract 5 g tryptone (or peptone) 5 g NaCl | 5 g yeast extract 10 g tryptone (or peptone) 测井设备10 g NaCl |
2 TY | 3.2 g Tryptone 2 g Yeast Extract 1 g NaCl [用5 N NaOH调pH值至7.0] | 8 g Tryptone 5 g Yeast Extract 2.5 g NaCl [用5 N NaOH调pH值至7.0] 旋转式清堵机 | 16 g Tryptone 10 g Yeast Extract 5 g NaCl [用5 N NaOH调pH值至7.0] |
SOC | 4 g Tryptone 1 g Yeast Extract 0.1 g NaCl 2 ml KCl (250 mmol/L) 1 ml MgCl2 (2 mol/L) 4 ml Glucose (1 mol/L) | 10 g Tryptone 2.5 g Yeast Extract 0.25 g NaCl 5 ml KCl (250 mmol/L) 2.5 ml MgCl2 (2 mol/L) 10 ml Glucose (1 mol/L) | 20 g Tryptone 5 g Yeast Extract 0.5 g NaCl 10 ml KCl (250 mmol/L) 5 ml MgCl2 (2 mol/L) 20 ml Glucose (1 mol/L) |
柔性电路 Note: 1. 溶液使用前,加入灭菌的MgCl2; 2. SOC培养基除含有20 mmol/L葡萄糖外,其他成分与SOB培养基相同。SOB培养基经高压灭菌后冷至60℃或以下,加20 ml除菌的1 mol/L葡萄糖溶液(1 mol/L葡萄糖溶液的配制方法是:用90 ml去离子水溶解18 g葡萄糖,完全溶解后,用去离子水定容至100 ml,用0.22 um滤器过滤除菌) |
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