1、目的 建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 2、适用范围 本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。
3、定义
标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。 4、职责
4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。
4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。
5、规程
5.1菌种的申购
部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。
5.2菌种的接收
菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。
5.3菌种的保存
5.3.1工作用菌种的保存
工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同，细菌：每个月转种一次；酵母菌及芽胞：3~6个月转种一次；丝状真菌每年转种一次。
5.3.2传代用菌种的保存
采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。
5.3.2.1甘油冷冻管保存法
用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度20%），即为10%甘油菌悬液，轻轻振摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，在-30℃冷冻条件下保存。此甘油冷冻管为第2代（G2）。可以每隔2年转种一代。使用时，取出一支放至室温，转种增菌培养或接种至琼脂斜面复苏，挑取纯菌落传代或工作用。此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏（如大肠埃希菌、金黄葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌）。 5.3.2.2液体石蜡保存法
5.3.2.2.1无菌液体石蜡的制备：选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，在121℃灭菌仿生花30分钟,置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。
5.3.2.2.2液体石蜡管的制备：将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适宜条件下培养
结束后，在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好的菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，置于-20℃冷冻或2～8℃冰箱中保存。此法主要适用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽孢杆菌的保存（如枯草芽孢杆菌、白念珠菌、黑曲霉菌等）。
5.3.3各菌种的保存方法、条件及期限，见下表1
表1 传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限
菌种名称 | 保存方法 | 保存温度 | 保存期限 |
大肠埃希菌〔CMCC(B)44102〕 | 甘油冷冻管 | -30℃ | 2年 |
金黄葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕 |
铜绿假单胞菌（CMCC（B）10104） |
枯草芽孢杆菌〔CMCC(B)63501〕 | 湍流耗散率
乙型副伤寒沙门菌〔CMCC(B)50094〕 |
白念珠菌〔CMCC(F)98001〕 | 液体石蜡管 | 2-8℃ | 1年 |
黑曲霉菌〔CMCC(F)98003 |
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5.4菌种的处理和保藏
5.4.1标准菌株的复苏、确认、传代
5.4.1.1标准菌株的复苏
5.4.1.1.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%隧道式高温烧结炉酒精棉球。
5.4.1.1.2培养基
改良马丁琼脂培养基：用于黑曲霉复苏、复壮；
液体硫乙醇酸盐培养基：用于生孢梭菌复苏、复壮；
营养肉汤培养基：用于金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮；
改良马丁培养基：用于白念珠菌复苏、复壮
5.4.1.1.3标准菌株的复苏操作步骤：
以下操作均在生物安全柜内进行。
a) 在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
b) 用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。
c) 以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。
d) 轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。
e) 用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。
f) 根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。
g) 若黑曲霉为菌悬液，则先放置室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1桑叶采摘器～2滴滴在
改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7天，斜面正面为黑褐厚绒状，泽均一，不应有杂，斜面侧面无，接近菌层培养基略带黄。确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。
h) 取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按f）项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1~2ml/管，分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认，其余作为储备管在-30℃冷冻条件下保存。黑曲霉按g）项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种菌悬液中1~2ml/管加石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，封存于冻存管，置于-20℃冷冻或2～8℃冰箱中保存。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。
i) 储备菌种管制备成功，储存于－30℃剖分轴承，有效期为两年。
5.4.1.2标准菌株的确认
a) 用无菌接种环取上述培养物接种到胰酪大豆胨琼脂（TSA）培养基（细菌）或沙氏葡萄糖琼脂培养基（真菌和酵母菌）平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上。
b) 然后在30～35℃下培养3天（细菌）；20～25℃下培养5天（真菌和酵母菌）。
c) 培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划4个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存和鉴定。
d) 鉴定时作革兰氏染、镜检，观察其染特性及形态特征。必要时再做生化实验以进一步鉴定该菌种。
e) 若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培养物灭活处理，并寻原因。应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。
f) 菌种的确认结果，记录在《菌种鉴定记录》上。
g) 各菌种的复活、划线用培养基、培养条件，见《菌种复活、划线用培养基、培养条件》（附件2）。
5.4.1.3菌种的传代
5.4.1.3.1标准菌株的传代
a) 按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适宜的增菌培养基内，称第桉树专用肥1代（G1），复壮后转接至平板上，并在适当温度下培养适当时间，分离单个纯种菌落，此为第2代（G2）。
b) 菌种确认后，挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管或液体石蜡管，作为保存菌种（G2），也称传代用菌种，同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种，此为第3代（W3）。
c) 将第2代（G2）菌种管冷冻保存，将工作用菌（W3）于适当温度下培养适当时间后用于日常检验。
d) 取一支冷冻保存的第2代（G2）菌种转种于平板和斜面培养基上。平板上的菌种制成冷冻保存管第3代（G3）；斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后用作工作用菌种，此仍为第3代（W3）。
e) 将第3代菌种（G3）冷冻或低温保存，将生长、转种后的第2代（G2）菌种经高温灭活处理后丢弃。
f) 按上述规程操作，直至G4转为W5为止，需重新开启冷冻干燥菌种，重复上述规程操作，保存和使用菌种。
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