一种扁核木种壳提取物作为酪氨酸酶天然激活剂的用途

1.本发明属于扁核木种壳提取物制备及应用领域，特别涉及一种扁核木种壳提取物作为酪氨酸酶天然激活剂的用途，本发明为预防、改善或白癜风、白化病等素减退症以及日化领域中的美黑原料方面提供应用方案。

背景技术：

2.酪氨酸酶（tyr）是一种关键的调节性的多功能酶，含铜，负责黑素的生物合成。酪氨酸酶能够催化由酪氨酸到黑素生成过程中的限速步骤，是生成黑素的关键酶类。酪氨酸酶缺失或活性减退会引起一系列的皮肤病，例如白癜风、白化病等等。酪氨酸酶激活剂近年来被认为是一种有效改善酪氨酸酶障碍引起的素缺失症状的药物而受到广泛关注。但是，一些临床上使用的酪氨酸酶激活剂如补骨脂素，常常与puva结合使用来关于黑素沉着障碍的皮肤病，然而该疗法不仅费用昂贵，还伴随着许多副作用，如光毒性，皮肤恶性肿瘤等。因此，开发一些价格低廉，易获得，无副作用的天然植物提取物作为酪氨酸酶激活剂是很有必要的。
3.扁核木（prinsepia utilis royle）属灌木，是蔷薇科，在中国云南、贵州、四川、巴基斯坦和印度北部等地区广泛分布。研究发现扁桃木的各个部位具有很好的生物活性，例如其叶子具有良好的抗氧化和抗骨质疏松活性，其种子常被用来榨油，不仅可用来食用，还有美容养颜功效，具有良好的抗菌活性。然而，在种油的生产过程中，会产生大量的工业废弃物，特别是种壳。因此，有必要开发食品加工副产物的潜在应用，提高其经济价值，目前尚未有关于扁核木种壳提取物对酪氨酸酶激活的相关报道。

技术实现要素：

4.本发明提供了一种扁核木种壳提取物的制备方法及在制备酪氨酸酶天然激活剂中的应用，具体的酪氨酸酶天然激活剂能应用在药物及日化产品中，本发明通过实验证明采用本发明公开的提取方法所获得的扁核木种壳提取物能够有效地激活酪氨酸酶活性，显著提高b16细胞内的黑素分泌，本发明为进一步开发利用扁核木种壳作提供了新的途径。
5.本发明目的通过以下技术方案实现：1、扁核木种壳提取物的制备将扁核木种壳冻干粉碎过筛（经40-80目筛筛分），在扁核木种壳粉末中添加石油醚脱脂，500g-1500g下离心，收集沉淀，沉淀物用甲醇-丙酮水溶液提取，500g-1500g下离心，收集上清液，浓缩去除溶剂后，用盐酸溶液将上清液ph调整为1-4，用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取，直至有机相无澄清后，收集水相，在水相中加入2-5mol/l氢氧化钠溶液进行水解，再加入盐酸溶液调节ph为1-4，用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取5-7次后，收集合并有机相，旋蒸冻干制得；所述甲醇-丙酮水溶液是体积浓度40-70%甲醇水溶液和体积浓度40-70%丙酮水溶液按体积比1:2-2:1的比例混合制得；乙醚-乙酸乙酯混合液是乙醚和乙酸乙酯按体积比1:
2-2:1的比例混合制得；调节ph的盐酸溶液的浓度为2-6mol/l；石油醚脱脂是添加石油醚后超声处理15-30min；2、扁核木种壳提取物活性检测本技术对扁核木种壳提取物激活体外酪氨酸酶活性进行了研究，实验结果显示本发明方法制得的扁核木种壳提取物具有显著激活酪氨酸酶的活性；扁核木种壳提取物对小鼠b16黑素瘤细胞内酪氨酸酶活性及黑素分泌实验结果显示，扁核木种壳提取物对b16细胞内酪氨酸酶有明显的激活作用，并能促进细胞内黑素的生成。
6.本发明扁核木种壳提取物的用途，是将扁核木种壳提取物用作制备酪氨酸酶天然激活剂，并用于制备和/或预防白癜风、白化病等素减退症药物或食品，或用作日化领域中的美黑原料。
7.本发明所述的药物、食品、日化产品的成分（或有效成分）为扁核木种壳提取物，还可以加入一种或多种药物、食品、日化产品上可接受的辅料，以改善药物、食品、日化产品的吸收效果或便于使用，如制成胶囊或丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等，即制成适宜的使用剂型。
8.与现有技术相比，本发明具有如下优点：1、本发明为扁核木种壳的应用提供了一个新的领域；2、本发明通过多种实验，发现扁核木种壳提取物不仅可以有效地激活体外酪氨酸酶，还能激活b16细胞中酪氨酸酶的活性，促进b16细胞中黑素的产生；3、扁核木植物可以适应恶劣的自然环境，在日常生活中原料易得，扁核木是天然植物，安全性高；扁核木种壳提取物来自于可食用的天然植物原材料，制备工艺简单、获得率高（6%-8%），市场前景可观、蕴藏着较好的社会和经济价值。
附图说明
9.图1为扁核木种壳提取物对酪氨酸酶酶的激活作用；图2为不同浓度扁核木种壳提取物对b16细胞存活率的影响；图3扁核木种壳提取物对b16细胞中的蛋白浓度（a图）、酪氨酸酶活性（b图）和黑素含量（c图）的影响；图4为培养基或50、100μg/ml扁核木种壳提取物（用培养基配置）作用于b16细胞48小时后细胞颜（a）及形态（b）观察图。
具体实施方式
10.下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明，但这些实施例不得用于解释对本发明的限制；下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售；在阅读了本发明的记载以后，本领域的科技人员对其等效的各种改动、修改和修饰，都属于本发明权利要求所限定的范围；实施例1：扁核木种壳提取物的制备将采集自云南丽江宁蒗县的扁核木种子的种壳剥下来，收集种壳并冻干打粉，过60目筛，获得种壳粉，在30g种壳粉种添加石油醚150ml，超声处理20min脱脂，800g离心10min，收集沉淀，沉淀物中加入甲醇-丙酮水溶液（体积浓度70%甲醇水溶液和体积浓度70%
丙酮水溶液按体积比1:1的比例混合制得）提取15min，800g下离心10min，收集上清液，在40℃下浓缩去除上清液中的有机试剂，用6mol/l盐酸溶液调节ph=2，在调节后溶液中添加乙醚-乙酸乙酯混合液（乙醚和乙酸乙酯按体积比1: 1的比例混合制得）萃取，直至有机相无澄清后，收集水相，在水相中加入4mol/l的氢氧化钠溶液（加入氢氧化钠溶液的体积是水相的体积的2倍）进行水解，再用6mol/l盐酸溶液调节ph=2，在调节后溶液中添加乙醚-乙酸乙酯混合液（乙醚和乙酸乙酯按体积比1: 1的比例混合制得）萃取6次后，收集合并有机相，40℃下旋蒸，浓缩液冻干，制得扁核木种壳提取物2.35g，获取率为7.83%。
11.实施例2：扁核木种壳提取物对酪氨酸酶激活作用的测定1、酪氨酸酶酶活测定方法以实施例1制得的扁桃木种壳提取物为实验样品，并用ph为6.8、浓度为0.2mol/l的磷酸缓冲盐溶液稀释制得浓度为50、100、150、200μg/ml的样品液；配制100u/ml的酪氨酸酶溶液，用ph为6.8、浓度为0.2 mol/l的磷酸缓冲盐溶液（pbs）配制3mmol/l的左旋多巴溶液作为底物反应液；设置空白组为120μl pbs溶液+40μl酪氨酸酶溶液+40μl左旋多巴溶液；空白对照组为160μl的pbs溶液+40μl左旋多巴溶液；样品组为80μl pbs溶液+40μl的样品溶液＋40μl酪氨酸酶溶液+40μl的左旋多巴溶液；样品对照组为120μl pbs溶液+40μl的样品溶液+40μl的左旋多巴溶液；每组设置3个复孔，整个反应体系在37℃孵育30min，在475nm下测量吸光值；具体计算公式如下：激活率%=（（b
1-b2）/（a
1-a2））
×
100公式中a1代表空白组的吸光度值，a2代表空白对照组的吸光度值，b1代表样品组的吸光度值，b2代表样品对照组的吸光度值。
12.2、实验结果扁核木种壳提取物对酪氨酸酶的激活结果如图1所示，从图中可以看出扁核木种壳提取物对酪氨酸酶的激活作用呈现剂量效应，随着浓度的增加，其激活效果逐渐增强，与空白组（设空白组的酪氨酸酶活力为100%）相比，不同浓度的提取物对酪氨酸酶的活率均显著上升（p＜0.05），当提取物浓度为200μg/ml时，其对酪氨酸酶活率达到159.24
±
0.99％，其ec50值为187.89
±
7.87μg/ml，由此可以看出扁桃木种壳提取物对酪氨酸酶活性有很好的激活作用。
13.实施例3：扁核木种壳提取物对小鼠b16黑素瘤细胞内酪氨酸酶活性及黑素分泌的影响1、细胞培养复苏小鼠b16黑素瘤细胞（本室传代冻存）。用dmem培养基进行培养，该培养基含有10%胎牛血清和1%青链霉素双抗；待细胞贴壁面积超过80%后，进行传代或接板；细胞培养需置于培养箱内，培养环境设置为温度37℃，浓度5% co2；2、细胞毒性实验将b16细胞以每孔8
×
104个细胞/ml的密度接种在96孔板中，培养24小时后添加新的dmem培养基（对照）、含不同浓度提取物的dmem培养基处理48小时，每组设置6个复孔；随后移除培养液并用磷酸缓冲盐溶液(pbs)洗涤2次，每孔加入200μl 0.5mg/ml噻唑蓝溶液（用pbs配置），细胞被作用4小时后，弃去孔中溶液，加入200μl二甲基亚砜，置于振荡仪上以
1500转/分钟处理10分钟，直至紫结晶全部溶解，在570nm处测定吸光度值，计算公式如下：细胞活率%=(od
570
样品)/(od
570
空白)
×
100选择50、100、150、200μg/ml作为样品毒性筛选剂量，研究扁核木种壳提取物对b16细胞存活率的影响；结果如图2所示，该提取物在150μg/ml、200μg/ml浓度下的细胞活率较空白组显著降低，与其呈显著性差异（p《0.05），即在150μg/ml以上浓度对b16细胞有毒性作用，而在50、100μg/ml该提取物浓度的作用下细胞存活率与空白组相比没有显著性差异（p《0.05）；因此选择50、100μg/ml作为实验剂量进行后续活性探究。
14.3、细胞内酪氨酸酶活性的测定采用l-dopa氧化法检测细胞内酪氨酸酶活性，具体是将b16细胞以每孔8
×
104个细胞/ml的密度接种在6孔板中，培养24小时后用新的dmem培养基（对照）、含不同浓度提取物的dmem培养基处理48小时，每组设置3个复孔；随后移除培养液并用磷酸缓冲盐溶液(pbs)洗涤2次，收集细胞，每孔加入150μl的细胞裂解液裂解，40min后，在温度4℃下以12000rpm离心15min，取离心后的100μl上清液于1.5ml ep管中并加入100μl浓度为6mmol/l的l-dopa溶液（用pbs配置，ph=6.8）混匀，在37℃温度下避光孵育1小时，至各孔有浅棕褐出现，在475nm处测定吸光度值，剩余上清用来检测各个孔中细胞对应的蛋白浓度，使用相对的蛋白浓度归一化计算相对酪氨酸酶活性，计算公式为：酪氨酸酶相对活性＝(od
475
样品/蛋白浓度)/(od
475
空白/蛋白浓度)
×
100％；结果见图3，图3a是细胞内蛋白浓度相对含量图，用于校准细胞内酪氨酸酶活性结果。扁核木种壳提取物对b16细胞中酪氨酸酶的激活结果如图3b所示，与空白组相比，扁核木种壳提取物对b16细胞内的酪氨酸酶活性的激活作用显著增加（p＜0.05），其ec50值为33.82
±
3.79μg/ml；同样图3c，与空白组相比，随着作用于b16细胞的扁核木种壳提取物浓度的增加，其细胞内黑素含量有极为显著的提高（p＜0.05），当提取物浓度为100μg/ml时，其黑素含量增长了5.03倍；结果表明，扁核木种壳提取物对b16细胞内酪氨酸酶有明显的激活作用，并能促进细胞内黑素的生成。
15.4、细胞内黑素含量的测定采用naoh裂解法测定细胞内的黑素含量，按上述方法操作，在裂解完毕后离心的下层沉淀物中加入1mol/l含10％二甲亚砜(dmso)的naoh溶液(每管150μl)，在80℃下水浴1小时，待沉淀物充分溶解后，在405nm的波长下测定其吸光值；相对黑素含量计算公式为：相对黑素含量＝(od
405
样品/蛋白浓度)/(od
405
空白/蛋白浓度)
×
100％；细胞观察结果见图4，图4a为dmem培养基（空白组）、含不同浓度提取物的培养基作用48小时收集细胞离心后的观察图，可直观看出与空白组相比，不同浓度的提取物作用于b16细胞后，离心下来的细胞颜加深，有明显的黑素沉积；图4b为dmem培养基（空白组）、含不同浓度提取物的培养基作用48小时后细胞形态观察图，可以看出空白组细胞呈现出多层，不规则生长；扁核木种壳提取物作用后，细胞呈一定的极性生长，平行排列，多数细胞不重叠，体积变大，具有树突状结构，细胞间连成网状，细胞出现黑素分泌的活化状态；实验进一步证实了扁核木种壳提取物可作为酪氨酸酶天然激活剂促进细胞黑素的生成。
16.综上，本发明所提供的提取方法制得的扁核木种壳提取物可以作为酪氨酸酶的天
然激活剂，能够在体外和细胞层面上有效地激活酪氨酸酶的活性，促进黑素的分泌。因此，本发明扁核木种壳提取物可以用来开发酪氨酸酶的天然激活剂。

技术特征：

1.一种扁核木种壳提取物在制备酪氨酸酶天然激活剂中的应用；所述扁核木种壳提取物是将扁核木种壳冻干粉碎过筛，在扁核木种壳粉末中添加石油醚脱脂，离心，收集沉淀，沉淀物用甲醇-丙酮水溶液提取，离心，收集上清液，浓缩去除溶剂后，用盐酸溶液将上清液ph调整为1-4，用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取，直至有机相无澄清后，收集水相，在水相中加入2-5mol/l氢氧化钠溶液进行水解，再加入盐酸溶液调节ph为1-4，用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取5-7次后，收集合并有机相，旋蒸冻干制得。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：甲醇-丙酮水溶液是体积浓度40-70%甲醇水溶液和体积浓度40-70%丙酮水溶液按体积比1:2-2:1的比例混合制得。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：乙醚-乙酸乙酯混合液是乙醚和乙酸乙酯按体积比1:2-2:1的比例混合制得。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：盐酸溶液的浓度为2-6mol/l。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：石油醚脱脂是添加石油醚后超声处理15-30min。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：离心是在500g-1500g下进行。

技术总结

本发明公开了一种扁核木种壳提取物在制备酪氨酸酶天然激活剂中的应用；所述扁核木种壳提取物是将扁核木种壳冻干粉碎过筛，在扁核木种壳粉末中添加石油醚脱脂，离心收集沉淀，沉淀物用甲醇-丙酮水溶液提取，离心收集上清液，浓缩去除溶剂后，用盐酸溶液调整上清液的pH，用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取，直至有机相无澄清后，收集水相，在水相中加入氢氧化钠溶液水解，再加入盐酸溶液调节pH，用乙醚-乙酸乙酯混合液萃取后，收集合并有机相，旋蒸冻干制得；本发明方法制得的扁核木种壳提取物在体外、B16细胞内对酪氨酸酶活性具有激活作用，并能促进细胞内黑素生成，本发明中扁核木种壳提取物作为酪氨酸酶天然激活剂具有较好的开发利用前景。发利用前景。发利用前景。