蚕豆脱皮机252例结直肠癌组织中KRAS、NRAS、 BRAF、PIK3CA的基因突变分析 刘影;郑细闰;朱亚珍;何青莲;郑广娟
【摘 要】目的 分析结直肠癌(colorectal cancer,CRC)组织中KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因的常见突变类型及其与临床病理指标的关系.方法 对252例CRC石蜡包埋组织进行DNA提取,采用Sanger测序法对KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因进行检测,分析各个基因的突变率与临床病理特征的关系,并统计各个基因的突变类型.结果 252例CRC中,KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA突变发生率在性别、年龄、肿瘤部位、病理分期和有无淋巴结转移上差异均无统计学意义(P＞0.05);检测阳性突变共140例(55.5％),其中KRAS 113例(44.8％),NRAS 1例(0.4％),BRAF 19例(7.5％),PIK3CA 28例(11.1％),包括PIK3 CA与KRAS、NRAS、BRAF基因发生双突变21例(8.3％);KRAS的主要突变类型包括G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13D、T20M、A59T、Q61H、Q61L、Q61P;NRAS仅有1例突变为G12D;BRAF的主要突变类型为V600E、D594G、K601E;PIK3CA的主要突变类型包括E542K、E545K、Q546K、Q546P、Q546R、M1043I、H1047R.PIK3CA与KRAS、NRAS、BRAF之间会发生交叉突变,但KRAS、NRAS 、BRAF三者之间基本不存在交叉突变.结论 CRC中KRAS阳性突变率居高,PIK3CA次之,BRAF、NRAS突变率最低,且PIK3CA常与KRAS、NRAS、BRAF发生交叉突变.对CRC患者行KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA等多基因检测,可正确指导并选择抗EGFR单抗药,从而实现真正意义上的个体化靶向.
【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》
【年(卷),期】2016(032)008
【总页数】6页(P851-855,859)
【关键词】结直肠肿瘤;Sanger测序;KRAS;PIK3CA;靶向
【作 者】刘影;郑细闰;朱亚珍;何青莲;郑广娟
【作者单位】广东省中医院病理科,广州510120;广东省中医院病理科,广州510120;广东省中医院病理科,广州510120;广东省中医院病理科,广州510120;广东省中医院病理科,广州510120
焗炉
【正文语种】力矩限制器中 文
【中图分类】R735.3人体3d建模
美国最新癌症统计结果显示，结直肠癌(colorectal cancer, CRC)发病率居全球常见恶性肿瘤的第3位，病死率居第4位[1]。随着CRC病死率逐年增高，临床标准的手术及放、化疗方案已满足不了现状[2]，伴随着精准医疗理念的准入，CRC的也迎来个体化靶向时代。据报道，针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的靶向药物酪氨酸激酶抑制剂(TKI，如吉非替尼和厄洛替尼)在EGFR基因突变的晚期癌症患者中疗效显著[3-5]，抗EGFR单克隆抗体药物(如西妥昔单抗、帕尼单抗)在EGFR信号通路相关基因野生型患者中有积极作用。近年来，抗EGFR单抗药在CRC患者中应用广泛，而且主要针对KRAS野生型的CRC患者[6]，但是除KRAS基因之外，EGFR信号通路下游的其他基因如NRAS、BRAF或PIK3CA等发生突变也会影响单抗药物的靶向作用[7,8]。因此，对KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA等多基因进行检测，更能准确预测抗EGFR单抗药物的疗效，从而真正实现个体化靶向。本实验采用Sanger测序法对CRC肿瘤组织中KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA的相关基因位点进行检测并统计分析，旨在总结上述基因突变率
与临床病理特征之间的关系以及常见突变类型，为个体化靶向提供分子病理学上的依据。
1.1 临床资料 收集2013年5月～2015年5月广东省中医院病理科存档的CRC石蜡包埋标本252例，均行肠癌套餐基因(包括KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA)检测。其中男性139例，女性113例；中位年龄60岁，≥60岁者167例，﹤60岁者85例；结肠癌190例，直肠癌62例；病理分期：Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ+Ⅳ期230例；有淋巴结转移者154例，无淋巴结转移者98例。
1.2 试剂 QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN公司)；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工公司)；BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司)；PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara公司)；Hi-Di Formamide 3500 Dx Series(Applied Biosystems公司)；超微量分光光度计ND-8000(Thermo Scientific公司)；3500-Dx Genetic Analyzer(Applied Biosystems公司)；TProfessional standard 96 Gradient(Biometra公司)；水平电泳仪(Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(Cambridge公司)。
1.3 DNA提取 采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取肿瘤组织基因组DNA。首先，挑
选肿瘤组织相对较多的蜡块切片，4 μm厚，共10张，进行脱蜡处理，另切一张厚2.5 μm切片进行HE染，选取肿瘤细胞较密集区域，用记号笔在载玻片的背面做标记。然后，根据HE染结果，刮取标记区域进行DNA提取，提取严格按照试剂盒说明书进行。提取后的DNA应用ND-8000超微量分光光度计进行浓度及质量测定，其符合标准为1.7<OD260/OD280<2.1，浓度超过100 ng/μl的标本须将浓度稀释到100 ng/μl。
1.4 Sanger测序法
防粘贴油漆1.4.1 PCR扩增及产物纯化 PCR反应条件：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性30 s，63～55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共循环16次(每个循环退火温度降0.5 ℃)；98 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共循环20次；最后于72 ℃延伸10 min；16 ℃保存10 min。PCR产物纯化：用1.5% 琼脂糖凝胶进行水平电泳，对照DL2000 DNA Marker(Takara公司)观察PCR扩增产物是否为单一目的条带。对符合目的片段大小的扩增产物根据 SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工公司)说明书，严格按照操作说明对PCR产物进行纯化。
1.4.2 测序反应及产物纯化 测序反应条件：96 ℃预变性1 min；96 ℃变性10 s，50 ℃
退火5 s，60 ℃延伸4 min，共循环25次；60 ℃延伸4 min；15 ℃保存10 min。测序产物纯化：采用乙醇/EDTA/NaAc纯化法纯化，最后加10 μl的去离子甲酰胺(HIDI)溶液进行溶解，于3500-Dx基因分析仪进行基因检测分析。本实验所用引物包括：KRAS-ex2-F：5′-ACCTTATGTGTGACATGTTC-3′；KRAS-ex2-R：5′-CTATTGTTGGATCATATTCG-3′；KRAS-ex3-F：5′-GAAGTAAAAGGTGCACTGTAATAAT-3′；KRAS-ex3-R：5′-CAATTTAAACCCACCTATAATGGT-3′；NRAS-ex2-F：5′-AGTACTGTAGATGTGGCTCGCC-3′；NRAS-ex2-R：5′-CCTCACCTCTATGGTGGGATC-3′；BRAF-ex15-F：5′-TAAACTCTTCATAATGCTTGCTC-3′；BRAF-ex15-R：5′-AGCCTCAATTCTTACCATCCAC-3′；PIK3CA-ex9-F：5′-AGTAACAGACTAGCTAGAGACAAT-3′；PIK3CA-ex9-R：5′-GAGATCAGCCAAATTCAGTTATTTT-3′；PIK3CA-ex20-F：5′-CAGGAGATGTGTTACAAGGCTTAT-3′；PIK3CA-ex20-R：5′-TCAGTTCAATGCATGCTGTTTAAT-3′。
1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，应用完全随机设计的两样本率进
行χ2检验，样本含量小于40的采用Fisher确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA的基因突变率与临床特征的关系 在252例CRC患者中，KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA突变发生率与性别、年龄、肿瘤部位、病理分期和淋巴结转移无关(P>0.05，表1)。2.2 KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA常见基因突变分析 252例CRC患者中，共检测阳性突变140例，约占总数的55.5%。其中KRAS突变率为44.8%(113/252)，NRAS突变率为0.4%(1/252)，BRAF突变率为7.5%(19/252)，PIK3CA突变率为11.1%(28/252)。KRAS突变主要发生在ex-2和ex-3外显子上，以codon12密码子突变类型较多，包括G12A、G12C、G12D、G12R、G12S和G12V，其中以G12D和G12V突变发生率较高；codon13密码子上G13D突变发生率亦较高，另可见几种较少见突变T20M、A59T、Q61H、Q61L、Q61P；NRAS突变仅发生1例，为G12D突变类型；BRAF突变主要发生在ex-15上，以codon600上的V600E突变发生率较高，另少见D594G和K601E突变；PIK3CA突变主要发生在ex-9和ex-20上，主要突变类型包括E542K、E545K、Q546K、Q546P、Q546R、M1043I、H1047R(表2，图1)。此外，PIK3CA与KRAS、NRAS、BRAF基因发生双突变者共计21例(表3)，约占检测总数的8.3%(21/252)，占突变总数的15.0%(21/140)，且占PIK3CA突变总数的75.0%(21/28)。其中，以PIK3CA
与KRAS双突变为主，约占双突变总数的90.5%(19/21)，少数与BRAF V600E同时发生突变，占9.5%(2/21)，而尚未检测到PIK3CA与NRAS双突变。另本组实验未见KRAS、NRAS与BRAF之间发生交叉突变。
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