双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
2D 电泳优越性
● 对未处理样本耐受性好
● 不需要预纯化(如：谱层析)
● 分辨率非常高
铍铜● 2D 可以有效的组分收集器
● 蛋白在凝胶介质中受到保护
球头挂环● 牛蒡去皮机在蛋白质组学技术中应用范围最广（front-end ）
● 触摸电视与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白点更多
● 与后续分析技术兼容性好
一、基本原理：先将蛋白质根据其等电点在pH梯度胶内（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度）进行等电聚焦，即按照它们等电点的不同进行分离。然后按照它们的相对分子质量大小进行SDS-PAGE第二次电泳分离。样品中的蛋白经过等点电和分子质量的两次分离后，可以得到分子的等电点、分子质量和表达量等信息。值得注意的是，双向电泳分离的结果使蛋白质点而不是条带。根据Cartesin坐标系统，从左到右是pI的增加，从下到上是分子质量的增加。 第一向：等电聚焦
1．[基本原理]
从电泳观点看，蛋白质最主要的特征是它的带电行为。蛋白质是由20种不同的氨基酸按不同比例通过肽键的连接构成的。由于蛋白质的一些氨基酸侧链在一定的pH值的溶液中是可
解离的，从而带有一定的电荷。构成蛋白质的所有氨基酸残基上所带正负电荷的总和便是蛋白质所带的净电荷。蛋白质在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电，在低pH时，蛋白质的净电荷是正的，在高pH时，其净电荷是负的，但在某一pH时，它的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoelectric pointpI）。蛋白质的等电点值取决于其氨基酸的组成，是一个物理化学常数。组成每一种蛋白质或多肽的氨基酸的数目和比例是不同的，因此蛋白质的等电点范围很宽，如某种α-酸性糖蛋白（chimpanzee）的pI可低达1.8，而人胎盘溶菌酶的pI可高达11.7，这样宽广的pI范围使得可以利用它来进行蛋白质的分离和分析。
等电聚焦电泳时，形成正极为酸性，负极为碱性的连续的、稳定的pH梯度。将某种蛋白质（或多种蛋白质的混合物）样品至于负极端时，因pH＞pI，蛋白质分子带负电，电泳时向正极移动；在移动过程中，由于pH逐渐下降，蛋白质分子所带的负电荷量逐渐减少，蛋白质分子移动速度也随之变慢；当pH＝pI时，蛋白质所带的净电荷为零，蛋白质即停止移动。同理当蛋白质样品至于阳极端时，因pH＜pI，蛋白质分子带正电，电泳时向负极泳动，移动过程中，pH不断升高，蛋白质所带的正电逐渐减少，速度也随之减慢，直到到达净电荷为零的等电点位置则停止移动。因此在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各
种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子会分别聚集于其相应的等电点位置，这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。各种不同的蛋白质在电泳结束后，形成很窄的一个区带，很稀的样品也可进行分离。在等电聚焦中蛋白质区带的位置，是由电泳的pH梯度的分布和蛋白质的pI所决定的，而与蛋白质分子的大小和形状无关。
蛋白质到达它的等电点位置后，没有净电荷，就不能进一步迁移。如果蛋白带向阴极扩散，将进入高pH范围而带负电，阳极就会将其吸引回去，直到回到净电荷为零的位置，同理，如果它向阳极扩散而带正电，阴极则将其吸引回净电荷为零的位置。因此蛋白质只能在它的等电点位置会被聚集成一条窄而稳定的带（见图-1）。所以等电聚焦不仅能获得不同蛋白质分离和纯化效果，同时也能得到蛋白质的浓缩效果。这种〝聚焦效应〞或称〝浓缩效应〞是等电聚焦最大的优点，是高分辨率的保证。
第二向 SDS-PAGE
1．[基本原理]
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂消除电荷、形状等因素的影响，使电泳迁移率只取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂和强还原剂后具有这种作用并建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。之后，Weber，Glossmann和Douglas等人进行了多次改进，已显示出了在分离、鉴定和纯化蛋白质方面的优越性。
SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子还原剂，作为变性剂和助溶性试剂，它能够断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构。强还原剂，例如β-巯基乙醇（β-mercapto ethanal）和二硫苏糖醇（dithiothreitol， DTT）则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS的充分结合。
当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和还原剂后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成蛋白质-SDS 复合物,这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质分子穿上了带有负电荷的“外衣”。蛋白质-SDS复合物所带的SDS负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，另一方面，
蛋白质-SDS复合物的形状是类似于“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度是恒定的，约为18埃，而长轴的长度则与蛋白质分子量大小成比例，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或者亚基的分子质量的大小。因此，SDS-PAGE可以按蛋白质的分子大小的不同将其
分开。当蛋白质亚基的分子质量在15kDa到200kDa之间时，电泳迁移率与分子质量的对数呈线性关系。若用已知分子量的一组蛋白质作图绘制标准曲线，在同样条件下检测未知样品，就可从标准曲线推算出未知样品的分子量。
二、蛋白质组分析的首要要求
将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。
导尿管原理2- DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。
三、经典工作流程
样品制备：细胞裂解、匀浆、预分级、除杂质、浓缩、 定量
等电聚焦电泳
IPG干胶条再水化
SDS—PAGE电泳
染
结果分析
四、样品制备
1、目标：是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用.
原则
2、制备原则：
①应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制
备方法应具有可重现性。
②防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
③防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。
④完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。
⑤尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。
3、不同样品的基本处理方法
可溶性样品
固体组织样品
细胞
可溶蛋白的样品，如体液，细胞和组织的萃取物能直接用于双向电泳。
固体样品，如组织，取物能直接用于双向电泳。
固体样品，如组织，细胞或在组织培养液的细胞，加样前应先破碎，通常使用的裂解液是
O’Farrell提出的9mol/L尿素和2％（w/v ）非离子去污剂（NP-40 或Triton X-100）
培养细胞（culture cell）：由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋白
药盒印刷
样品的分级处理：通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质
样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。
4、样品制备的基本步骤：破碎、沉淀、溶解、去除杂质
1）破碎——最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解原则
破碎的方法有许多种，包括循环冻融法、渗透法、去污剂法、酶裂解法、超声波法、高压法、液氮研磨法、机械匀浆法和玻璃珠破碎法等（可以归纳为机械法、化学法和物理法），这些方法有不同的应用范围，但基本的原则都是要以最小的限度减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解。
1、较易破碎的细胞组织：
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