×××院 临床分子生物实验室质量手册 | 文件编号： |
序号： | 共 1 页 |
第 版 | 第 次修改 |
主题：HMM-2型医用核酸分子快速杂交仪标准操作程序 | 颁 布 日 期： |
| | 刘若仪 |
HMM-2型医用核酸分子快速杂交仪标准操作程序
一、目的：
规范仪器操作，确保仪器实验的正常进行。
二、适用范围：
临床分子生物实验室HMM-2型医用核酸分子快速杂交仪。
三、职责：
由临床分子生物实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、程序：
金属工艺品制作4.1 注意事项
4.1.1 杂交操作应在专用杂交试验室完成。
4.1.2当进入杂交试验室的时候,应穿杂交试验室专用工作服。
4.1.3 试验全程均须带一次性手套。
4.1.4 实验所用离心管及头都为已灭菌的。
4.1.5 准备好装废弃头的废液缸，在废液缸内加入20ml 10%次氯酸钠；弃置头垂直将头小心打入盛有10%次氯酸钠的废液缸中，确保移液前臂没有碰到废液缸口。 4.1.6 NBT/BCIP 溶液。
4.1.6.1 NBT/BCIP溶液使用后应储存在4oC 条件下。
4.1.6.2 如果发现紫或蓝沉淀出现在NBT/BCIP溶液中,请更换并准备新鲜NBT/BCIP溶液。
4.2 试验前准备
4.2.1 打开水浴锅，将温度调至45℃。
4.2.2 从冰箱中取出杂交试剂盒，将所有杂交检测试剂放置在室温下,使其温度平衡到室温。 4.2.3 将杂交液试剂瓶放入45C水浴锅中预热。
4.2.4 如果使用之前发现溶液B有沉淀，则可在45℃水浴条件下溶解,然后将其温度平衡到室温条件。
4.3 HMM-2型医用核酸分子快速杂交仪准备
4.3.1确认杂交仪电源已与杂交仪相连接。
4.3.2打开HMM-2型医用核酸分子杂交仪电源。
4.3.3在杂交仪后面的废液出口处安装好废液缸，在废液缸内加入20ml 10%次氯酸钠；（注：若实验中途需要倾倒废液缸中废液，则在倒完之后重新加入10%次氯酸钠，继续实验）。
4.3.4根据控制面板指示，选定[Manual Mode], 按[Enter]键进入温度设定界面，输入温度为45℃后，再按[Enter]键确认并进行升温；。
4.3.5用60ml左右蒸馏水充满反应室，放置好金属多孔板并打开水泵，排出多孔板上面的水分后关闭水泵。
4.3.6将与实验样品数相对应孔数的塑料薄膜放置在金属多孔板上。
4.3.7用镊子将杂交膜放置在塑料薄膜对应开孔上，如有多余开孔则用parafilm封口膜或塑料片覆盖，这一步要确保杂交膜湿润且没有气泡；杂交膜放置的时候要注意用来定位的两个加号向上放置。
4.3.8在杂交膜上面放置硅胶封圈和15孔分隔室，固定好压扣盖（注意：固定时应对准反应室尾部两个孔按下往前推到底）。
4.3.9开泵，泵走残留在膜上的水珠，关泵。
注意: 开泵意味着将杂交膜上的所有液体全部排除完全,然后才关泵。
4.4导流杂交操作
4.4.1 从水浴锅中取出预热到45℃的杂交液，在有杂交膜的杂交孔内加入0.8ml预热至45℃的杂交液，盖上盖板温育至少2分钟。将杂交液放回水浴锅中继续水浴。
4.4.2 从冰箱中取出所要杂交的PCR产物，溶解后放入离心机点动离心, 放PCR仪中进行95℃变性5 min。
4.4.3 从冰箱中取出冻有冰块的塑料盒，加适量自来水，制成冰水后，将刚好变性5min的PCR管从PCR仪中取出，立即放入冰水中，放置时间应不少于2min。
4.4.4 开泵，排出预杂交的杂交液，关泵。
4.4.5 从水浴锅中取出预热到45℃的杂交液，吸取0.5ml预热的杂交液，加到反应槽每个孔中。
4.4.6 按照样本编号，将冰水浴中PCR产物取出，全部吸取加入到反应槽孔中，用头轻力混匀（此步骤的移液头均要求每加一个样本换一次，并且不要用力吹打，以免移液受污染）。依次按照样品编号执行以上步骤，直到所有实验样本均加入到杂交孔中,然后盖上盖板，45℃条件下杂交蛭石板10min。将杂交液重新放入水浴锅中；如果这些样本中有阴性对照和阳性对照样本，则将阴性对照加入第一个分隔孔，阳性对照加入最后一个分隔孔。
4.4.7 杂交10min后，开泵进行导流杂交，将杂交膜上的溶液排净，关泵。
从水浴锅中取出预热到45℃的杂交液，吸取0.8ml冲洗膜，开泵将杂交膜上的溶液排净，关泵；此步骤重复三次。
显过程：
4.4.8 按[ESC]键进入温度修改界面，设定杂交仪温度为25℃后按[Enter]键确
认。
4.4.9 加入0.5ml封阻液封闭膜，当温度降至30℃时，开泵排净所有预封阻的封阻液，关泵。
4.4.10再加入0.5ml封阻液封闭膜，盖上盖板封闭5 min(此步不必降到25℃就
可进行)；开泵，完全排净0.5ml封阻液，关泵。
机床数据采集4.4.11 在温度为25℃(±1℃)时, 加入0.5ml酶标液，盖上盖板温育3.5分钟；
开泵，将0.5ml酶标液彻底排净，关泵。
4.4.12 按[ESC]键进入温度修改界面，设定杂交仪温度为36℃后按[Enter]键确
认。
4.4.13 吸取0.8ml溶液A冲洗膜，开泵将杂交膜上的溶液彻底排净，关泵；此步
骤一共重复四次。
4.4.14 当温度达到 36oC ( 1.0oC)，将NBT/BCIP溶液棕小瓶取出，摇匀，加
入0.5ml NBT/BCIP溶液，盖上盖板显，显反应大概持续3-5min。
4.4.15 开泵,泵出所有NBT/BCIP溶液。
4.4.16 吸取0.8ml溶液B冲洗膜，开泵将杂交膜上的溶液排净，关泵；此步骤一
共重复三次。
4.4.17 吸取2ml左右蒸馏水冲洗膜，开泵将杂交膜上的溶液排净，关泵。
4.4.18 打开压扣盖,拿走分隔室,用镊子取出杂交膜并放在吸水纸上吸干杂交膜
上的水分；根据记录本记录样本所放顺序，将样本编号用铅笔写在杂交膜左下方。
4.5 试验后处理
4.5.1 用蒸馏水充满反应室，开泵泵出所有蒸馏水，再加入蒸馏水充满反应室， 开泵泵出。
4.5.2 将杂交用多孔板、塑料薄膜、分隔硅胶圈及分隔室用自来水清洗一遍，并用蒸馏水冲
洗一遍。
4.5.3 清理盛废头的废品缸，将所有废品取出到远离杂交工作台的地方，倒入塑料袋中，封口后丢弃。
4.5.4 将所用使用的杂交试剂放入 4oC 冰箱中保存。
4.5.5 关闭杂交仪电源，用纸巾擦净反应室内残留水珠。
4.5.6 将清洗干净的杂交用多孔板、塑料薄膜、分隔硅胶圈及分隔室，用纸巾擦净，摆放在反应室上，开着盖板，使其自然风干。
4.6 结果记录
4.6.1 对实验中一些突发性问题（不包括在杂交标准操作规程）及实验结果记录。
4.6.2 撰写具体实验结果报告。
频率补偿
4.7 记录使用情况。
制 定 者 | 审 核 者 | 批 准 者 |
| | |
年 月 日 | 年 月路缘石滑模 日 | 年 月 日 |
| | |
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议