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常用的柱层析方法
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体积排阻（Size Exclusion）层析 也称分子筛、凝胶过滤层析或凝胶渗透层析。其工作原理是利用蛋白质分子量或分子外形的差异实现分别。 体积排阻层析柱的柱床由多孔介质填料组成，当样品从层析柱的顶端向下运动时，大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒而快速洗脱，小的蛋白质分子能够进入凝胶颗粒内，其在凝胶内部的迁移被延迟。因此，蛋白质从柱中被洗脱的挨次普通按分子量由高到低。体积排阻层析主要用来从蛋白质溶液中去除低分子量的缓冲液成分和盐。 (1) 挑选适当的层析柱假如需要从复杂原料中将全部较大分子量的分子（如大于5000Da )的物质与小分子（5000Da以下）物质分开，可以挑选排阻极限小的层析柱，如Sephadex G-25填料的柱子；假如要分别相对分子量相差不大的柱子，可按照各种凝胶的排阻范围举行挑选。固然也可以购买填料自己装柱，但试验结果的重复性、稳定性不如预装柱。 (2）挑选适当的缓冲液了解样品的稳定性，挑选保证样品性质稳定的pH和离子强度的缓冲液。须要时，可以取少量样品举行测试。 多数状况下可用水作缓冲液，为了避开非特异性吸附或者对于一些在纯水中溶解度较低的蛋白质，常采纳缓冲盐溶液举行洗脱。对于一些吸附性强的物质也可采纳水和有机溶剂的混合物举行洗脱。 (3）样品的处理样品在上样前普通要举行离心或过滤处理，以去除影响层析柱分别效果的杂质并可防止柱子堵塞。 少量样品普通在1000g离心15 min，细胞裂解液在4000-5000g离心30min，去除脂质和细胞碎片。 挑选过滤的滤膜孔径与填料颗粒的孔径大小相关。对于与滤膜有非特异性结合的样品，应用离心代替过滤。 (4）上样量为了达到良好的分别效果，上样量必需保持较小的体积，普通为柱体积的2％-5%。 (5）洗脱与收集洗脱过程中应保持流速稳定，不宜过快。收集时应该按照样品的量和试验的目的挑选适当的组分来收集。【关键词】常用 柱层析 办法 上一篇： 下一篇： 屋顶融雪装置>cpich
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