柱层析技术也称柱谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配，将不同组分逐一分离。象纸
硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。根据填充基质和样品分配交换原理不同，离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析是三种分离混合物的经典层析技术。
1、柱层析操作方法的选择
背胶橡皮布
目前，柱谱分离的操作方式，主要包括常压分离、减压分离和加压分离3种模式。常压分离是最简单的分离模式方便、简单，但是洗脱时间长。减压分离尽管能节省填料的使用量，但是由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发，并且有时在柱子外面会有水汽凝结，以及有些易分解的化合物也难以得到，而且还必须同时使用水泵或真空泵抽气。加压分离可以加快淋洗剂的流动速度，缩短样品的洗脱时间，是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗液更快洗脱。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵等。
2、柱子规格的选择
市场上有各种规格的柱层析分离柱。柱子长了，相应的塔板数就高，分离就好。目前市场上的柱子，其径高比一般在1: 5～10范围，在实际使用时，填料量一般是样品量的30～40倍，具体的选择要根据样品的性质和含量进行具体分析。如果所需组分和杂质的分离度较大，就可以减少填料量，使用内径相对较小的柱子(如 2 cm × 20 cm的柱子) ；如果Rf相差不到0.1，就要加大柱子，增加填料量，比如用3 cm内径的柱子。
3、装柱
柱层析谱柱的填装主要有湿法和干法两种，湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。柱子底端的活塞一定不要涂润滑剂，否则会被淋洗剂带到淋洗液中，可以采用聚四氟乙烯材料的阀门。干法和湿法装柱没什么实质性差别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该有适度的紧密(太密了淋洗剂流速太慢)，并且一定要均匀，不然样品就会从一侧斜着流动。同时柱中不能有大气泡，大多数情况下有些小气泡没太大的影响，因为只要加压气泡就可消失。但是柱子更忌讳的是开裂，开裂会影响分离效果，甚至报废。
4、溶剂的选择
极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；
极性较大的用甲醇：氯仿系统；
极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；
抛磨拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。
选择一个合适的溶剂系统是柱层析分离的关键。在选用柱层析洗脱剂时首先要考虑三个方面的因素：溶解性、亲合性和分离度。溶剂应选择价廉、安全、环保的，可以考虑石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。但正己烷价格较高，乙醚很易挥发，二氯甲烷和甲醇与硅胶的吸附是一个放热过程，易使柱子产生气泡。其他的溶剂用的相对较少，要依不同需要选择。另外值得一提的是，由于我们进行的是痕量分析，淋洗剂的纯度必须关注，一般使用农药残留级或HPLC级的，如果是分析纯的必须进行精制。同时溶剂在过柱后最好回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费。
5、上样
用少量的溶剂溶解样品加样，加完后将底端的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白的了。加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶解样品的溶剂和样品层有一段距离(2～4 cm)，再加压，这样避免了溶剂(如二氯甲烷等)夹
带样品快速下行。很多样品在上柱前粘性较大，上样后在柱上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为填料对样品的吸附饱和所致。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂(比如DMF,DMSO等)又不能上柱，这样就必须用干法上柱了。
渣油四组分6、淋洗液的收集和浓缩
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出，这时可以采用氧化铝作固定相。柱层析后的淋洗液，由于使用了较多的溶剂，必须进行浓缩，如果待测物具有一定的挥发性，最好使用常压挥发溶剂，否则易导致检测结果偏低。
7、经验总结连供系统
装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。
降温母粒湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂"走柱子"，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。
干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再
填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂"走柱子"，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于"走柱子"时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个
柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、一定要用较多的溶剂"走柱子"，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。
上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量芗洗涤后，再加入。
湿法较方便，柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否，对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是：在柱层析时，由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀（没有填严实），使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导致分离效果不好。更常见的例子是：层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰当，结果导致几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见，这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工作量，减少有机溶剂的使用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议