现学biomecicnjournals Progress in Modern Biomedicine VoL21 NO.6 MAIL2021 • 1001 •
d o i: 10.13241/j k i.p m b.2021.06.001
•基础研究•
3D打印PCL/p-TCP可降解椎间融合器的体外降解及生物力学研究* 于小迪1李小康1薛丹2伍苏华3刘文文1郭硕1吴昊1郭征1△(1空军军医大学西京医院骨科陕西西安710032;2西安石油大学化学化工学院陕西西安710065;
3维度(西安)生物医疗科技有限公司陕西西安710311)
摘要目的：研究以质量配比为5:5的聚己内酯(PCL)与磷酸三钙（p-TCP)为原材料，应用3D打印技术制备的的可降解的颈椎椎 间融合器在体外的降解特性，为临床应用提供理论依据。方法：将制备好的融合器浸泡于模拟体液中，置于37-C温箱，每2周更换 浸泡液，按浸泡时间的不同分为六组：分别为空白对照组、2周、4周、12周、26周、52周组。每组浸泡前后经室温真空干燥后用同 一天平测量质量，计算失重质量及失重率，应用凝胶渗透谱仪分析各组融合器中PC L的分子量变化，并应用INSTRON万能试 验机进行抗压强度力学测试。空白对照组为样本室温密闭容器放置，在初始称重并检测分子量及抗压强度测试，52周后计算失重 率、检测分子量及抗压强度。结果：该种可降解椎间融合器初始抗压强度达到 （23.21± 2.28)MPa，在体外降解52周后其抗压强度 下降不明显，为（丨8.99± 0.49)MPa(P>0.05)；其在体外可缓慢降解，52周后失重率约9.23%(P<0.05)，其中PC L分子量从初始的 10万左右降至7万左右(P<0.05)r结论：该种可降解椎间融合器抗压力学强度适中且能长时间维持，符合临床应用要求，其在体 外可缓慢降解，评估其在生物体内的降解吸收特性较好，在人体椎间融合手术中应用的可行性及有效性较高。
关键词:3D打印；聚己内酯；磷酸三钙；椎间融合器；体外降解；生物力学
中图分类号:R681.5;R318.8;Q6-3 文献标识码:A文章编号：1673-6273(2021 )06-1001-07
In vitro Degradation and Biomechanical Study of 3D Printed PCL/p-TCP
Degradable Intervertebral Fusion Cage*
YVXiao-di1, LI Xiao-kang1, XUE Dan2, WU Su-hua3, LIU Wen-wen'y GUO Shuo'y WU Hao1, GUO Zheng1A
(1 Department o f O rthopedics, Xijing Hospital, Air Force Military Medical University, X ir a n, Shaanxi, 710032, China;
2 College o f C hemistry and Chemical Engineering, Xi'an Petroleum University, Xi'an, Shaanxi, 710065, China;
3 Wei DU (Xi 'an) Biomedical Technology Co. LTD, Xi'an, Shaanxi, 710311, China)
ABSTRACT Objective:The aim o f this study was to assess the degradation characteristics o f the biodegradable cervical interverte-bral fusion cage[made o f polycaprolactone(PCL)and p-tricalcium phosphate(p-TCP)with a mass ratio o f5:5] prepared by3D printing technology,which provides theoretical basis for clinical application.Methods:The prepared fusion cage was immersed in simulated body fluid,placed in a37 °C incubator,and the immersion solution was changed every two weeks.According to the different immersion time, it was divided into six groups:blank control group,2 weeks,4 weeks, 12 weeks, 26 weeks, 52 weeks group.Every cage o f each group was dried by vacuum drying at room temperature before and after soaking,then its weight was measured by the same balance,and the weight loss and weight loss rate were calculated.The molecular weight o f PCL in each cage was analyzed by gel permeation chromatograph,and the compressive strength was tested by INSTRON universal testing machine.In the blank control group,the samples were placed in sealed containers at room temperature,weighed initially and tested for molecular weight and compressive strength.After 52 weeks,the weight loss rate,molecular weight and compressive str
ength were calculated.Results:The initial compressive strength o f this kind o f degradable intervertebral fiision cage was(23.21 ± 2.28 MPa),and the strength did not decrease significantly(18.99± 0.49 MPa) after52 weeks o f degradation in vitro(P>0.05); the weight loss rate was about9.23% after52 weeks(P<0.05), and the molecular weight o f PCL decreased from around 100,000 dropped to around70,000(P<0.05). Conclusion:The biodegradable intervertebral fusion cage has moderate compressive strength and can be maintained for a long time,which meets the requirements o f clinical application.It can be degraded slowly in vitro,and its biodegradation and absorption characteristics in vivo are evaluated to be good.Therefore,its application in human intervertebral fusion surgery is feasible and effective.
*基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFC1104900)；国家自然科学基金面上项目（51771227)
作者简介：于小迪（1978-)，男，博士研究生，主治医师，主要研究方向：3D打印及可降解吸收骨替代材料，E-mail: 132****************△通讯作者：郭征（1%5_)，博士生导师，教授，主任医师，主要研究方向：骨病骨肿瘤的基础与临床研究、骨科植人材料与3D打印技术的基础研究及临床应用，E-mail:******************
(收稿日期：2020-08-10接受日期：2020-09-05)
电梯井防护门
•1002 •现物医学biomecLcnjoumals Progress in Modern Biomedicine VoL21 NO.6 MAR^021
Key words:3D printing;Polycaprolactone (PCL);p-tricalcium phosphate (p-TCP);Intervertebral fusion cage;In vitro degradation; Biomechanics
Chinese Library Classification(CLC):R681.5; R318.8; Q6-3 Document code:A
Article ID: 1673-6273(2021)06-1001-07
刖目
自20世纪50年代前路椎间盘切除椎间融合手术(ACDF)开展以来，椎间融合器的材料也经历了不断的进步，从自体骨、钛合金到目前临床普遍应用的PEEK(聚醚醚酮树脂)材料，均各有优缺点，如自体骨融合效果好，但存在取骨区疼痛等问题[11。钛合金材料有质量轻，强度高，多孔材料经改性处理有骨长人促进成骨的优点，但其弹性模量过高，有压缩终板骨质发生下沉等不利影响|2)，现临床已很少应用。PEEK材料融合器组织相容性好，强度高，弹性模量与皮质骨接近' 是良好的椎间融合器材料，但研究显示其存在应力分散且对椎体终板处理要求较高，对术后融合疗效有一定程度的影响|41。因此探索新型融合器材料提高椎间融合效果仍很有必要。我们发现可降解材料PCL(聚己内酯)结合生物陶瓷p-TCP(磷酸三钙)作为骨缺损替代材料有很好的支撑强度及成骨效应，具有良好的组织相容性及骨整合
作用，并可降解吸收15]。因此我们应用3D生物打印技术设计制备了 P C L与p-T C P配比为5:5的可降解椎间融合器。为进一步了解并模拟其在体内的降解特性及力学性能，我们进行了体外降解及力学的实验研究，以期为临床应用提供理论依据及技术指导。
褐变度1材料与方法
1.1材料
1.1.1可降解融合器的设计与制备医用级聚己内酯（PCL)粉剂(瑞典博斯托，分子量为10万）与磷酸三钙(P-TCP)粉剂(苏州鼎安）。PC L与p-T C P粉末以5:5质量配比加人混合器混匀(高速搅拌机和双螺杆挤出机），在U5'C融化混合后制备成5 m m直径棒材，将棒材装人3D打印机(EZAU3D打印机，型号:DW-B I )中，采用快速成型辅助设计软件设计融合器模型，将模型数据导人3D打印机逐层打印制备成边缘及中心纵隔为实体、中心为网状多孔结构的椎间融合器，为圆角梯形多孔结构，下底长10 m m，上底长14 mm，高11 mm，厚度5 mm，质量943.0±23.811^，体积约42〇1111115，孔隙率约2〇%。（见图1)。
图1融合器外观结构图
Fig. 1Structure and appearance of Cage
1.1.2模拟体液根据《YY/T0474-2004外科植人物用聚L-丙交酯树脂及制品体外降解试验》标准配制磷酸盐缓冲液(Sorensen缓冲液），用无菌二次蒸馏水配制的含磷酸二氢钾和磷酸氢二钠。先配制:a).l/15 mmol/L磷酸二氢钾：每升水中溶解9.078 g磷酸二氢钾;b).l/15 mmol/L磷酸氢二钠：每升水中溶解11.876g磷酸氢二钠。用18.2 %(体积分数）的溶液a)与81.8 %的溶液b)混合得到实验用的磷酸盐缓冲液，经滤菌器过滤灭菌备用，该缓冲液p H值为7.4± 0.2。
1.1.3恒温箱维持体外降解温度于37± 1 °C。
1.1.4电子天平精度至0.1 mg。
丨.1.5rNSTRON万能试验机测试材料的抗压力学强度。
1.1.6凝胶渗透谱仪（GPC)分析材料降解过程中PCL分子量的变化。
1.1.7扫描电镜进行材料表面形貌分析。
1.1.8真空干燥器
1.2方法
1.2.丨分组按预计浸泡时间分六组：空白对照组，2周,4周，12周，26周，52周，各组样本量12个，其中6个用于计算失重率，6个用于抗压强度测试，所有样本最后都用于检测PC L分子量。空白对照组中6个样本在开始实验时进行抗压强度测试及PCL分子量检测，另6个样本为室温密闭容器放置,52周后计算失重率、检测PC L分子量及抗压强度测试。在降解前及体外降解52周后应用扫描电镜进行材料表面的形貌分析。
1.2.2模拟体液浸泡体外降解依据《YY/T0474-2004外科植人物用聚L-丙交酯树脂及制品体外降解试验》标准，将所有实验样品分别放人无菌密闭容器内，用浸泡液覆盖样品并密闭容器，浸泡液体积为30 mL。使样品完全浸没于浸泡液中。将浸泡完成的容器放置于恒温箱内维持在37± 1 °C的生理温度，每2周更换浸泡液一次。
1.2.3失重率计算用于计算失重率的实验样本在浸泡降解前先于室温下真空干燥48小时至恒重，逐一用天平称重(记为W0)并编号，精确至0.1 m g；然后经钻60辐照灭菌后置于上述模拟体液中浸泡，于浸泡后的2周,4周，12周,26周,52周，每个时间点取出6个样品，用去离子水漂洗样品三次，
室温真空
现代生物医学进展biomedjournals Progress in Modem Biomedicine VoL21 NO.6 MAR2021• 1003 •
干燥48小时至恒重，用天平称重，记为W l。计算失重率=[初始质量W0-降解后质量W l]/W〇x1〇〇%。
1.2.4抗压强度测试根据国标《GB/T 1041-2008/IS0604: 2002塑料压缩性能的测定》将空白对照样品在37± 1°C的蒸馏水中状态调节60士 15 min，然后从蒸馏水（体外降解样品从浸泡液）中取出直接进行力学实验，应用INSTRON万能试验机进行抗压强度测试，测试速度为:2.5 mm/min，单位为MPa。
1.2.5 PCL分子量检测应用凝胶渗透谱仪（型号为Agilent Technologies PL-GPC 50Integrated GPC System) 检测各组样品中PCL的分子量，将样品干燥后放人氯仿溶液，其中PCL 溶解，P-TCP沉淀，离心取上清液，用0.45 pm的滤膜进行过滤，滤去少量不溶性杂质，用微量进样器量取15〇 滤液，从进样口注入凝胶渗透谱系统，以四根凝胶谱柱串连，以氯仿作流动相，在流速为1mL/m in下进行测定，取数均分子量Mi^0
2结果
2.1融合器的结构及形貌分析
融合器中心为网状空心结构，有利于早期降解及骨组织长人融合，在低倍扫描电镜(HITACHI S-4800)下可见对照组表面尚平滑，高倍镜下轻度粗糙。在经体外降解52周后可见其表面明显粗糙，这与PCL降解后p-T C P析出有关。见图2。
图2扫描电镜外观形貌分析
Fig.2 SEM images before and after degradation in vitro
2.2大体外观变化
各组在体外降解不同时间后仍保持外观结构的完整，在降解52周后外观细节损失较多。见图3。
2.3降解丟失质量及失重率
各组随降解时间延长质量缓慢丢失，至52周时失重率达到9.23 %，见表1。绘制随时间、失重率变化的降解曲线图可见该曲线较为平直，见图4。
2.4抗压强度测试
2.4.1压缩应力应变曲线见图5，应用INSTRON万能试验机检测该融合器的抗压强度，根据应力应变曲线可见，该融合器在高度压缩至60 %以上时，受到的压缩应力达到60 M P a以上，根据临床应用需求，取其压缩应变去除后外形无破损，高度可恢复的临界点(约压缩应变的30 %)的压缩应力值为其抗压强度。
2.4.2抗压强度随降解时间变化的力学曲线在体外降解52周后，该融合器抗压力学数值下降较少，各组之间无显著性差异，见表2。随时间变化的力学曲线较平直，见图6。
2.5 PCL分子量变化
用于该融合器的PC L初始分子量约10万，随着降解时间的延长分子量逐渐减小，至52周时降解至7万左右，见表3。PCL分子量随降解时间的曲线呈平缓下降趋势，见图7。
3讨论
根据世界卫生组织(W HO)的调查研究，中国人中颈腰痛导致的疾病负担位列第2位\随着现代生活节奏的加快和工作生活方式的改变，颈椎病及腰椎间盘突出症的发病率逐年增高，且患者平均年龄越来越低在临床上颈、腰椎间盘突出现多采用各种人路的椎间盘切除后行椎间融合手术。自Simth 与Robinson于20世纪50年代提出了颈椎前路椎间盘切除椎间植骨手术(ACDF)的手术方法[81，现已在临
床上广泛应用，椎间植骨的材料也经历了不断的改进，最早多采用取自体髂骨植骨融合，但自体骨有植骨块脱出、取骨区疼痛等缺陷后椎间融合器的材料不断发展，从钛合金到目前临床应用最多的聚醚醚酮树脂(PEEK)材料1»1，以及各种异体骨及可吸收材料的探索|I U\可以看出，一是融合器材质从高弹性模量向低弹性模量发展，使其能更适合椎体骨质的强度，减少椎板塌陷椎间隙容积减小的风险；二是从更高的组织相容性向可被组织降解吸收替代方向发展，使其能更好的成骨融合，提高手术成功率，减少术后并发症。目前PEEK材料的融合器应用广泛，
但仍存在骨
.1004 •现代生物医学biomedjournals Progress in Modern Biomedicine VoL21 NO.6 MAR.2021
整合不良等不足之处，其弹性模量仍较高，抗压强度达到130 仍可引起终板塌陷，椎间高度丧失的问题％，且其无生物活性，Mpai'大大高于人体颈椎终板抗压强度（约35-57 Mpa)及腰仅起到支撑的作用，融合仍需要其内填充的骨质来完成。因此椎终板的抗压强度(约39-69 M p a r#。在骨质疏松病人中应用探索并应用新型材料的融合器仍很有必要。
('ontrol group before Control group after 2 necks j*roup hefort* 2 weeks }»roup after
4 weeks uroup before 4 necks ur«»up after蓬2、、ffk s group lu.furc 12 weeks uroup after
燃料棒26 weeks ^roup before 26 weeks uroup after 52 weeks uroup before 52 necks (*roup aflcr
图3各组体外降解前后外观对照
Fig.3 The appearance of each group was compared before and after degradation in vitro
表1各组的失重率[失重率=(初始质量WO-降解后质置W l)/W〇x l〇〇%]
丁able 1The weight loss rate of each group[\veight loss rate=(Initial weightWO-Post-degradation weightWl)/W〇x 100%]
Time Initial weight WO(mg)Post-degradation weightW1
(mg)
Weight loss(mg)Weight loss rate(%)
Control group942.7± 24.6942.4± 24.50.3± 0.10.03%
2 week group931.5± 28.1926.8± 27.9 4.7± 0.40.51%
4 week group950.1± 28.4939.0± 27.911.2± 1.3 1.17%无铁硫酸铝
12 week group947.0± 21.1924.6± 20.022.4± 1.5* 2.37%
26 week group942.6± 24.0896.9± 24.645.7± 1.0* 4.84%
盐酸储存罐52 week group944.2± 22.1857.1± 23.087.1± 1.9*9.23% Note: n=6, compare with control group, */><0.05.
表2体外降解不同时间的抗压力学强度(d s)(M Pa) Table 2 Compessive strength at different time of degradation in vitro
(j c± s H M P a)
Time Compressive strength Control group(0 week)23.21± 2.28
2 week group20.82± 1.42
4 week group21.90± 0.60
12 week group20.88± 0.40
26 week group19.85± 0.60
52 week group18.99± 0.49
Control group(52 w eek)22.70± 1.10
Note: n=6, compare any two group,P>0.05.
表3各组PC L分子置值(v± ^
Table 3 PCL molecular weight of each group( jc± s)
Time PCL molecular weight Control group(0 w eek)101402± 5416
2 week group98944± 3586
4 week group94758土3258*
12 week group88717± 3011*
26 week group82716± 4605*
52 week group70882± 3658*
Control group! 52 w eek)1015331 4338 Note: 12,
compare with control group, *P<0.05.
现物医学biomedjournals Progress in Modern Biomedicine VoL21 NO.6 MAR2021•1005 •Degradation time(week)
图4随时间、失重率变化的降解曲线图
Fig.4 Degradation curve with time/weight loss rate
degradation time(week)
图6随时间变化的抗压力学曲线图
Fig.6 Compressive strength curve with degradation time
在椎间融合器的材料选择与设计发展中，其最终目的是通过融合器维持椎间隙的高度，利用融合器中心及周围的植骨使上下椎体的骨质与椎体间的骨质生长融合为一体从而保持脊柱结构的稳定，防止上下椎体节段不稳造成椎体的移位引起疼痛或压迫脊髓神经导致手术失败。但是临床上经常会出现融合器引起终板骨质压缩、塌陷等导致脊柱失稳，融合不佳的问题，尤其在患重度骨质疏松症的病例这多是由于钛合金及PEEK融合器较高的弹性模量导致的。如前所述，正常人体颈椎、腰椎的终板抗压强度约35-69 Mpa3我们前期设计的3D打印纯网状多孔可降解融合器强度只有6.38 MpaM，其支撑强度较差，尚不能满足临床使用要求。在此基础上，结合目前临床使用的融合器外观与我们前期的经验，设计制备了此种边缘及中心纵隔为实体框架，其余部分为多孔网状结构的颈椎椎间融合器。经力学测试结果可见其初始抗压强度达到了 23 M pa左右，略低于正常的椎体终板强度，因此其能减少终板塌陷的风险，在体外降解过程中其强度下降不明显，在体外降解52周后抗压强度约19 M pa左右(与对照组比较，P>0.05)。因此该设计结构并应用3D打印制备的配比为5:5的PCL-TCP颈椎椎间融合器，其力学强度符合临床应用需求。
聚己内酯(PCL)是骨组织支架中应用最广泛的生物材料之一，具有良好的生物相容性，无毒性及免疫原性，可降解吸收，是良好的体内植人材料[2<0。但研究发现PCL降解缓慢，且作为骨组织填充替代材料无成骨活性。而P-T C P与硫酸钙和羟基磷灰石比较，在体内具有适中的吸收速度及良好的刺激成骨的效应，是良好的骨缺损修复材料[2V41。因此将PC L与p-TCP
C o m p re s s io n s tra in (%)
图5融合器压缩应力应变曲线图
Fig.5 Compression stress-strain curve of fusion cage
Fig. 7 Molecular weight curve of PCL with degradation time
作为复合材料作为骨缺损修补材料有良好的前景.Khojasteh 将其作为复合支架，植人骨髓间充质细胞.成功修复了犬的下颌骨的垂直骨缺损|251;Park在体外研究中显示PCL-T C P支架可促进细胞增殖与提高碱性磷酸酶活性，是口腔应用和再生的良好材料|261；并且将其作为骨科植人支架材料亦有大量的研究报道i2U81。我们前期应用3D打印设计制备了 P C L与P-T C P配比为8:2，孔隙率为75 %的网状圆形椎间融合器（直径10 mm，厚度为5 m m)，并进行了羊颈椎融合动物实验，在术后12个月时显示出良好的椎间融合效果，证实其有良好的组织相容性及骨整合作用。但因其P C L含量较高且为纯
网状结构，孔隙率高，因此抗压强度较低，仅有6.38 Mpa，且降解缓慢，在术后12月时应用Micro-C T三维重建评估体积分数显著下降，但空间结构仍然完整[|91。在此基础上，通过调整材料的配比制备融合器并进行力学强度测试我们发现，随着其中P-TCP 含量的增加融合器抗压强度也逐渐增强，但P-T C P含量超过50 %以上时材料的混匀及制备难度增加，且随着(3-T C P含量增加材料的降解速度也增快|29]，因此为提升融合器的抗压强度、增快降解速度并兼顾制备工艺这三者的关系，我们最终选择PCL与p-T C P为5:5配比，应用3D打印制备的椎间融合器，期望其有较好的抗压强度，合适的降解速度并与成骨能良好P?配，促进骨质融合，提高临床效果
椎间融合器在临床使用中，理论上其成骨融合过程与骨折愈合过程类似，原始骨痂形成期需3-6个月，骨挪改建塑型约需1-2年的时间因此椎间融合术后3个月后逐渐出现骨性骨痂的连接与融合™，
所以可降解融合器维持其抗压强度至少
绿隔热玻璃
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议