一种快速检测中药中沙门氏菌的检测方法

1.本发明涉及沙门氏菌的检测方法技术领域，具体为一种快速检测中药中沙门氏菌的检测方法。

背景技术：

2.沙门氏菌是目前已知的最常见的食源性病源菌之一，其对人类的威胁已有数百年之久，每年全球感染沙门氏菌的人数超过1亿，其中亚太地区的感染率普遍高于其他地区，而在我国已知的细菌性食物中毒案件中大多数由沙门氏菌引起,并且主要通过肉类制品感染。在传统中药材特别是名贵中药材中，动物源材占很大比例，如海龙、蛤蚧、鹿血、穿山甲等，这类药材在炮制、运输及销售过程中的环境控制远不及食品，极易感染沙门氏菌，但最后却是同样被食入腹中，并且尚有很多药效较好的中药材为动物的粪便，如夜明砂、望月砂、蚕砂、五灵脂、鸡矢白等，这类药物经过动物的整个消化道，更容易被沙门氏菌感染，增加了用药的风险性。
3.目前关于使用中药造成细菌感染的报道虽然不多，但是通过查阅相关不良反应记录及走访中医院相关科室发现：临床实践中确实存在疑似细菌感染的不良反应症状。目前关于中药饮片中病源性微生物的检查并没有法定标准，对于成药的检测方法是采用培养法，在实际监管工作中药品往往是采用抽检方式，在现场进行抽样后送至检测中心进行检验，这种监管方式对中成药及中药饮片的掺假、掺伪等质量问题比较适用，但是由于药材及成药的细菌污染具有局部性、随机性并且在发生感染时需要及时处理，所以日常抽样的监管方式并不能保证中药饮片及中成药的生物安全性。

技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种快速检测中药中沙门氏菌的检测方法，具备了利用免疫磁珠能特异性的吸附目的细菌，可以直接从样品中富集病原菌，减少前增菌过程，降低检测时间，提高检测率。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种快速检测中药中沙门氏菌的检测方法，包括以下步骤：
6.(1)取沙门氏菌标准菌株(atcc14028)，12株a-f0价沙门氏菌，利用沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制；
7.(2)提取待纯化测样品：将步骤(1)中的沙门氏菌a-f菌株分别接种营养肉汤，37℃培养过夜；接种于营养琼脂平板，37℃培养18-24h，用灭菌生理盐水洗下菌苔，盛入灭菌生理盐水瓶中,并进行细菌计数进行制纯；
8.(3)将步骤(2)中制备纯化后的兔抗沙门氏菌(12株a-f0价沙门氏菌)进行收集多克隆抗体，随后利用沙门氏菌特异性吸附免疫磁珠的制备；
9.(4)基于上述制备的兔抗沙门氏菌多克隆抗体制备免疫磁珠建立并优化实验方法以特异性捕捉中药中沙门氏菌，利用免疫磁珠法提取中药饮片中沙门氏菌核酸；
10.(5)基于上述制备的兔抗沙门氏菌多克隆抗体制备快速检测胶体金试纸条并建立检测中药中的沙门氏菌的快速检测方法，利用中药饮片中沙门氏菌实时荧光定量pcr(qpcr)检测方法的研究；
11.(6)根据genbank中公布的沙门氏菌序列设计引物及探针建立沙门氏菌实时荧光定量pcr检测方法，并结合上述制备的免疫磁珠建立适用于中药中沙门氏菌的检测方法。
12.可选的，步骤(1)中：沙门氏菌分别为:甲型副伤寒沙门氏菌(iqcc10518)、乙型副伤寒沙门氏菌(iqcc10504)、猪沙门氏菌(iqcc10502)、病牛沙门氏菌(iqcc10510)、肯塔基沙门氏菌(iqcc10530)、布伦登卢普沙门氏菌(iqcc10542)、伤寒沙门氏菌(iqcc10593)、肠炎沙门氏菌(iqcc10512)、鸭沙门氏菌(iqcc10509)、山夫登堡沙门氏菌(iqcc10520)、阿伯丁沙门氏菌(iqcc10511)、旺兹沃斯沙门氏菌(iqcc10515)及对照菌株(大肠杆菌iqcc10103)进行复苏培养，制备菌液以备用。
13.可选的，(1)中沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制分为：
14.1.1、胶体金的制备：取1％氯金酸1ml加入到含99ml去离子双蒸水中，所得氯金酸溶液浓度为0.01％，置于带冷凝装置的三角烧瓶中加热至沸腾，在磁力加热搅拌下快速加入1％的枸橼酸三钠水溶液2ml,继续加热直至溶液呈葡萄酒。冷却后置于棕瓶中4℃冰箱保存；
15.1.2、金标抗体的制备：取需制备量的胶体金溶液，用0.1mol/lk2co3分别调其ph至9.0，然后按每1ml胶体金溶液加入15ug纯化的普通兔抗体，磁力搅拌混合均匀，30min后加入10％牛血清白蛋白溶液至终浓度1％,继续搅拌15min后再加入5％peg20000(聚乙二醇,mw20000)至终浓度为0.5％，再继续搅拌15min，然后置于4℃冰箱过夜。次日将此液先以1500r/min离心10min，取上清液以13000r/min离心1h，取沉淀用胶体金稀释液溶解后置4℃冰箱保存；
16.1.3、免疫层析检测条的制备：将偶联好的兔抗沙门氏菌抗体-1的胶体金喷在玻璃纤维膜上，兔抗沙门氏菌抗体-2和羊抗兔抗体分别喷在硝酸纤维膜检测线区和对照线区的相应位置上，烘干备用，把试纸条各组分按顺序分别贴附在不干胶底板的相应位置上:吸水纸、硝酸纤维膜、含胶体金玻璃纤维膜，然后切割成4mm宽的纸条，装入一个特制的塑料卡内。
17.可选的，步骤(2)中：将菌液稀释至100亿个细菌/ml，将不同的菌株等体积混合后加入0.5％的甲醛灭活24h，灭活期间振荡数次，灭活后菌液经细菌检验平板不再长菌。灭活后的菌液用灭菌生理盐水洗涤3次，重新稀释成100亿个细菌/ml,与弗氏完全佐剂1：1混合，用于免疫家兔，1ml/只，耳静脉注射，连续注射8次，每次间隔5天，第一次免疫后将弗氏完全佐剂替换为弗氏不完全佐剂，其余步骤相同，免疫完成后中间停15天，后采用同样方法再连续注射8次,经测试合格者颈动脉放血,分离血清，需要纯化的血清,采用proteina sepharosetmcl-4b(蛋白a琼脂糖凝胶4b)柱进行纯化,其余血清分装冷冻保存。
18.可选的，步骤(3)中沙门氏菌特异性吸附免疫磁珠的制备为：
19.3.1、试剂：为纳米级磁球，上述制备的兔抗沙门氏菌多克隆抗体
20.3.2、免疫磁珠的制备：取1mg磁珠于1.5ml离心管中，用1ml磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤2次后，重悬于100ulpbs缓冲液中；加入400μl新配制的5mg/mledc和5mg/mlnhs混合溶液，充分混合，37℃活化磁珠30min，pbs缓冲液洗涤2次。将活化好的磁珠与约50μg多克隆抗体
混合，37℃偶联2.5h，偶联完成后移去多余液体，加1％bsa于37℃封闭30min，pbs缓冲液洗涤2次，室温保存备用。实际操作中再根据抗体偶联率进行适当优化
21.3.3、免疫磁珠偶联率的测定：通过微量紫外分光光度计(thermo nanodrop onec)测定偶联后上清液中剩余的抗体量，间接计算出偶联到磁珠表面的抗体量，再计算抗体的偶联率。
22.可选的，步骤(4)中免疫磁珠法提取中药饮片中沙门氏菌核酸为：
23.4.1、免疫磁珠捕获沙门氏菌菌悬液中目的菌：将沙门氏菌菌悬液及免疫磁珠加入提取板的孔中，设计相应的程序进行沙门氏菌的吸附和洗脱。提取结束后，将富集后的复合物100μl转移至1.5ml离心管，采用培养，或者裂解后测定所提核酸浓度的方法，评估免疫磁珠的捕获能力
24.4.2、免疫磁珠法提取中药饮片中沙门氏菌核酸：将培养后稀释成一定浓度的菌液加到动物类中药饮片中，按上述方法进行梯度实验，计算免疫磁珠应用于中药饮片的捕获能力。
25.8.可选的，步骤(5)中药饮片中沙门氏菌实时荧光定量pcr(qpcr)检测方法的研究为：
26.5.1、引物与探针的设计：选择沙门氏菌ttr位点为靶基因，暂定引物及探针设计如下：
27.上游引物：5
’‑
tcaccaggagattacaacatgg-3’，
28.下游引物：5
’‑
agctcagaccaaaagtgaccat-3’，
29.taqman探针：5
’‑
(fam)accgacggcgagaccgacttt-3’30.5.2、荧光定量pcr反应：暂定qpcr方案如下：反应总体积20μl,其中的premixtaq(2
×
)10μl，上、下游引物各0.2μmol/l，taqman探针0.35μmol/l，模板dna0.5μmol/l，补齐去离子水至20μl。暂定运行程序如下：95℃预变性60s；95℃变性5s，60℃延伸20s，于此步开始收集荧光信号，运行45个循环。每次检测时设阴性对照和空白对照，同时以沙门氏菌atcc14028标准菌株的dna作为阳性对照，实际操作过程中再对解链及退火温度和时间进行优化。
31.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
32.本发明利用免疫磁珠能特异性的吸附目的细菌，可以直接从样品中富集病原菌，减少前增菌过程，降低检测时间，提高检测率；
33.本发明能够基于已制备的兔抗沙门氏菌多克隆抗体制备免疫磁珠建立并优化实验方法以特异性捕捉中药中沙门氏菌；
34.本发明能够制备快速检测胶体金试纸条建立检测中药中的沙门氏菌的快速检测方法；
35.本发明能够建立沙门氏菌实时荧光定量pcr检测方法，并结合上述制备的免疫磁珠建立适用于中药中沙门氏菌的检测方法，能够针对中药沙门氏菌检测的多组分干扰问题，通过所制备的免疫吸附磁珠，对中药中存在沙门氏菌先进行富集，再以胶体金试纸条和荧光定量pcr法进行检测，可排除其他物质的干扰；
36.本发明能够基于免疫吸附和实时荧光定量pcr法建立两种中药中沙门氏菌的快速检测方法可以随时随地、快速准确地检测中药中的沙门氏菌，以更全面、及时地保障人民的
用药安全。
附图说明
37.图1为本发明流程图。
具体实施方式
38.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.请参阅图1，本发明提供一种快速检测中药中沙门氏菌的检测方法，包括一下步骤：
40.(1)取沙门氏菌标准菌株(atcc14028)，12株a-f0价沙门氏菌，利用沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制；
41.(2)提取待纯化测样品：将步骤(1)中的沙门氏菌a-f菌株分别接种营养肉汤，37℃培养过夜；接种于营养琼脂平板，37℃培养18-24h，用灭菌生理盐水洗下菌苔，盛入灭菌生理盐水瓶中,并进行细菌计数进行制纯；
42.(3)将步骤(2)中制备纯化后的兔抗沙门氏菌(12株a-f0价沙门氏菌)进行收集多克隆抗体，随后利用沙门氏菌特异性吸附免疫磁珠的制备；
43.(4)基于上述制备的兔抗沙门氏菌多克隆抗体制备免疫磁珠建立并优化实验方法以特异性捕捉中药中沙门氏菌，利用免疫磁珠法提取中药饮片中沙门氏菌核酸；
44.(5)基于上述制备的兔抗沙门氏菌多克隆抗体制备快速检测胶体金试纸条并建立检测中药中的沙门氏菌的快速检测方法，利用中药饮片中沙门氏菌实时荧光定量pcr(qpcr)检测方法的研究；
45.(6)根据genbank中公布的沙门氏菌序列设计引物及探针建立沙门氏菌实时荧光定量pcr检测方法，并结合上述制备的免疫磁珠建立适用于中药中沙门氏菌的检测方法。
46.参阅图1、步骤(1)中：沙门氏菌分别为:甲型副伤寒沙门氏菌(iqcc10518)、乙型副伤寒沙门氏菌(iqcc10504)、猪沙门氏菌(iqcc10502)、病牛沙门氏菌(iqcc10510)、肯塔基沙门氏菌(iqcc10530)、布伦登卢普沙门氏菌(iqcc10542)、伤寒沙门氏菌(iqcc10593)、肠炎沙门氏菌(iqcc10512)、鸭沙门氏菌(iqcc10509)、山夫登堡沙门氏菌(iqcc10520)、阿伯丁沙门氏菌(iqcc10511)、旺兹沃斯沙门氏菌(iqcc10515)及对照菌株(大肠杆菌iqcc10103)进行复苏培养，制备菌液以备用。
47.参阅图1、步骤(1)中沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制分为：
48.1.1、胶体金的制备：取1％氯金酸1ml加入到含99ml去离子双蒸水中，所得氯金酸溶液浓度为0.01％，置于带冷凝装置的三角烧瓶中加热至沸腾，在磁力加热搅拌下快速加入1％的枸橼酸三钠水溶液2ml,继续加热直至溶液呈葡萄酒。冷却后置于棕瓶中4℃冰箱保存；
49.1.2、金标抗体的制备：取需制备量的胶体金溶液，用0.1mol/lk2co3分别调其ph至9.0，然后按每1ml胶体金溶液加入15ug纯化的普通兔抗体，磁力搅拌混合均匀，30min后加
入10％牛血清白蛋白溶液至终浓度1％,继续搅拌15min后再加入5％peg20000(聚乙二醇,mw20000)至终浓度为0.5％，再继续搅拌15min，然后置于4℃冰箱过夜。次日将此液先以1500r/min离心10min，取上清液以13000r/min离心1h，取沉淀用胶体金稀释液溶解后置4℃冰箱保存；
50.1.3、免疫层析检测条的制备：将偶联好的兔抗沙门氏菌抗体-1的胶体金喷在玻璃纤维膜上，兔抗沙门氏菌抗体-2和羊抗兔抗体分别喷在硝酸纤维膜检测线区和对照线区的相应位置上，烘干备用，把试纸条各组分按顺序分别贴附在不干胶底板的相应位置上:吸水纸、硝酸纤维膜、含胶体金玻璃纤维膜，然后切割成4mm宽的纸条，装入一个特制的塑料卡内。
51.参阅图1、步骤(2)中：将菌液稀释至100亿个细菌/ml，将不同的菌株等体积混合后加入0.5％的甲醛灭活24h，灭活期间振荡数次，灭活后菌液经细菌检验平板不再长菌。灭活后的菌液用灭菌生理盐水洗涤3次，重新稀释成100亿个细菌/ml,与弗氏完全佐剂1：1混合，用于免疫家兔，1ml/只，耳静脉注射，连续注射8次，每次间隔5天，第一次免疫后将弗氏完全佐剂替换为弗氏不完全佐剂，其余步骤相同，免疫完成后中间停15天，后采用同样方法再连续注射8次,经测试合格者颈动脉放血,分离血清，需要纯化的血清,采用proteina sepharosetmcl-4b(蛋白a琼脂糖凝胶4b)柱进行纯化,其余血清分装冷冻保存。
52.参阅图1、步骤(3)中沙门氏菌特异性吸附免疫磁珠的制备为：
53.3.1、试剂：为纳米级磁球，上述制备的兔抗沙门氏菌多克隆抗体
54.3.2、免疫磁珠的制备：取1mg磁珠于1.5ml离心管中，用1ml磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤2次后，重悬于100ulpbs缓冲液中；加入400μl新配制的5mg/mledc和5mg/mlnhs混合溶液，充分混合，37℃活化磁珠30min，pbs缓冲液洗涤2次。将活化好的磁珠与约50μg多克隆抗体混合，37℃偶联2.5h，偶联完成后移去多余液体，加1％bsa于37℃封闭30min，pbs缓冲液洗涤2次，室温保存备用。实际操作中再根据抗体偶联率进行适当优化
55.3.3、免疫磁珠偶联率的测定：通过微量紫外分光光度计(thermo nanodrop onec)测定偶联后上清液中剩余的抗体量，间接计算出偶联到磁珠表面的抗体量，再计算抗体的偶联率。
56.参阅图1、步骤(4)中免疫磁珠法提取中药饮片中沙门氏菌核酸为：
57.4.1、免疫磁珠捕获沙门氏菌菌悬液中目的菌：将沙门氏菌菌悬液及免疫磁珠加入提取板的孔中，设计相应的程序进行沙门氏菌的吸附和洗脱。提取结束后，将富集后的复合物100μl转移至1.5ml离心管，采用培养，或者裂解后测定所提核酸浓度的方法，评估免疫磁珠的捕获能力
58.4.2、免疫磁珠法提取中药饮片中沙门氏菌核酸：将培养后稀释成一定浓度的菌液加到动物类中药饮片中，按上述方法进行梯度实验，计算免疫磁珠应用于中药饮片的捕获能力。
59.参阅图1、步骤(5)中药饮片中沙门氏菌实时荧光定量pcr(qpcr)检测方法的研究为：
60.5.1、引物与探针的设计：选择沙门氏菌ttr位点为靶基因，暂定引物及探针设计如下：
61.上游引物：5
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tcaccaggagattacaacatgg-3’，
62.下游引物：5
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agctcagaccaaaagtgaccat-3’，
63.taqman探针：5
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(fam)accgacggcgagaccgacttt-3’64.5.2、荧光定量pcr反应：暂定qpcr方案如下：反应总体积20μl,其中的premixtaq(2
×
)10μl，上、下游引物各0.2μmol/l，taqman探针0.35μmol/l，模板dna0.5μmol/l，补齐去离子水至20μl。暂定运行程序如下：95℃预变性60s；95℃变性5s，60℃延伸20s，于此步开始收集荧光信号，运行45个循环。每次检测时设阴性对照和空白对照，同时以沙门氏菌atcc14028标准菌株的dna作为阳性对照，实际操作过程中再对解链及退火温度和时间进行优化。
65.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：

1.一种快速检测中药中沙门氏菌的检测方法，其特征包括以下步骤：(1)取沙门氏菌标准菌株，12株a-f0价沙门氏菌，利用沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制；(3)提取待纯化测样品：将步骤(1)中的沙门氏菌a-f菌株分别接种营养肉汤，37℃培养过夜；接种于营养琼脂平板，37℃培养18-24h，用灭菌生理盐水洗下菌苔，盛入灭菌生理盐水瓶中,并进行细菌计数进行制纯；(3)将步骤(2)中制备纯化后的兔抗沙门氏菌进行收集多克隆抗体，随后利用沙门氏菌特异性吸附免疫磁珠的制备；(4)基于上述制备的兔抗沙门氏菌多克隆抗体制备免疫磁珠建立并优化实验方法以特异性捕捉中药中沙门氏菌，利用免疫磁珠法提取中药饮片中沙门氏菌核酸；(5)基于上述制备的兔抗沙门氏菌多克隆抗体制备快速检测胶体金试纸条并建立检测中药中的沙门氏菌的快速检测方法，利用中药饮片中沙门氏菌实时荧光定量pcr检测方法的研究；(6)根据genbank中公布的沙门氏菌序列设计引物及探针建立沙门氏菌实时荧光定量pcr检测方法，并结合上述制备的免疫磁珠建立适用于中药中沙门氏菌的检测方法。2.根据权利要求1所述的一种快速检测中药中沙门氏菌的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中：沙门氏菌分别为:甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、猪沙门氏菌、病牛沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、布伦登卢普沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌、山夫登堡沙门氏菌、阿伯丁沙门氏菌、旺兹沃斯沙门氏菌及对照菌株进行复苏培养，制备菌液以备用。3.根据权利要求1所述的一种快速检测中药中沙门氏菌的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制分为：1.1、胶体金的制备：取1％氯金酸1ml加入到含99ml去离子双蒸水中，所得氯金酸溶液浓度为0.01％，置于带冷凝装置的三角烧瓶中加热至沸腾，在磁力加热搅拌下快速加入1％的枸橼酸三钠水溶液2ml,继续加热直至溶液呈葡萄酒，冷却后置于棕瓶中4℃冰箱保存；1.2、金标抗体的制备：取需制备量的胶体金溶液，用0.1mol/lk2co3分别调其ph至9.0，然后按每1ml胶体金溶液加入15ug纯化的普通兔抗体，磁力搅拌混合均匀，30min后加入10％牛血清白蛋白溶液至终浓度1％,继续搅拌15min后再加入5％peg20000至终浓度为0.5％，再继续搅拌15min，然后置于4℃冰箱过夜，次日将此液先以1500r/min离心10min，取上清液以13000r/min离心1h，取沉淀用胶体金稀释液溶解后置4℃冰箱保存；1.3、免疫层析检测条的制备：将偶联好的兔抗沙门氏菌抗体-1的胶体金喷在玻璃纤维膜上，兔抗沙门氏菌抗体-2和羊抗兔抗体分别喷在硝酸纤维膜检测线区和对照线区的相应位置上，烘干备用，把试纸条各组分按顺序分别贴附在不干胶底板的相应位置上:吸水纸、硝酸纤维膜、含胶体金玻璃纤维膜，然后切割成4mm宽的纸条，装入一个特制的塑料卡内。4.根据权利要求1所述的一种快速检测中药中沙门氏菌的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中：将菌液稀释至100亿个细菌/ml，将不同的菌株等体积混合后加入0.5％的甲醛灭活24h，灭活期间振荡数次，灭活后菌液经细菌检验平板不再长菌，灭活后的菌液用灭菌生理盐水洗涤3次，重新稀释成100亿个细菌/ml,与弗氏完全佐剂1：1混合，用于免疫家
兔，1ml/只，耳静脉注射，连续注射8次，每次间隔5天，第一次免疫后将弗氏完全佐剂替换为弗氏不完全佐剂，其余步骤相同，免疫完成后中间停15天，后采用同样方法再连续注射8次,经测试合格者颈动脉放血,分离血清，需要纯化的血清,采用proteina sepharosetmcl-4b柱进行纯化,其余血清分装冷冻保存。5.根据权利要求1所述的一种快速检测中药中沙门氏菌的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中沙门氏菌特异性吸附免疫磁珠的制备为：3.1、试剂：为纳米级磁球，上述制备的兔抗沙门氏菌多克隆抗体；3.2、免疫磁珠的制备：取1mg磁珠于1.5ml离心管中，用1ml磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤2次后，重悬于100ulpbs缓冲液中；加入400μl新配制的5mg/mledc和5mg/mlnhs混合溶液，充分混合，37℃活化磁珠30min，pbs缓冲液洗涤2次，将活化好的磁珠与约50μg多克隆抗体混合，37℃偶联2.5h，偶联完成后移去多余液体，加1％bsa于37℃封闭30min，pbs缓冲液洗涤2次，室温保存备用，实际操作中再根据抗体偶联率进行适当优化；3.3、免疫磁珠偶联率的测定：通过微量紫外分光光度计测定偶联后上清液中剩余的抗体量，间接计算出偶联到磁珠表面的抗体量，再计算抗体的偶联率。6.根据权利要求1所述的一种快速检测中药中的沙门氏菌的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中免疫磁珠法提取中药饮片中沙门氏菌核酸为：4.1、免疫磁珠捕获沙门氏菌菌悬液中目的菌：将沙门氏菌菌悬液及免疫磁珠加入提取板的孔中，设计相应的程序进行沙门氏菌的吸附和洗脱，提取结束后，将富集后的复合物100μl转移至1.5ml离心管，采用培养，或者裂解后测定所提核酸浓度的方法，评估免疫磁珠的捕获能力。4.2、免疫磁珠法提取中药饮片中沙门氏菌核酸：将培养后稀释成一定浓度的菌液加到动物类中药饮片中，按上述方法进行梯度实验，计算免疫磁珠应用于中药饮片的捕获能力。7.根据权利要求1所述的一种快速检测中药中的沙门氏菌的检测方法，其特征在于：所述步骤(5)中药饮片中沙门氏菌实时荧光定量pcr检测方法的研究为：5.1、引物与探针的设计：选择沙门氏菌ttr位点为靶基因，暂定引物及探针设计如下：上游引物：5
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tcaccaggagattacaacatgg-3’，下游引物：5
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agctcagaccaaaagtgaccat-3’，taqman探针：5
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(fam)accgacggcgagaccgacttt-3’，5.2、荧光定量pcr反应：暂定qpcr方案如下：反应总体积20μl,其中的premixtaq10μl，上、下游引物各0.2μmol/l，taqman探针0.35μmol/l，模板dna0.5μmol/l，补齐去离子水至20μl，暂定运行程序如下：95℃预变性60s；95℃变性5s，60℃延伸20s，于此步开始收集荧光信号，运行45个循环，每次检测时设阴性对照和空白对照，同时以沙门氏菌atcc14028标准菌株的dna作为阳性对照，实际操作过程中再对解链及退火温度和时间进行优化。

技术总结

本发明公开了一种快速检测中药中沙门氏菌的检测方法：所述快速检测中药中的沙门氏菌的检测方法包括：(1)取沙门氏菌标准菌株(ATCC14028)，12株A-F0价沙门氏菌，利用沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制；(2)提取待纯化测样品：将步骤(1)中的沙门氏菌A-F菌株分别接种营养肉汤，37℃培养过夜；接种于营养琼脂平板，37℃培养18-24h，用灭菌生理盐水洗下菌苔，盛入灭菌生理盐水瓶中,并进行细菌计数进行制纯。本发明利用免疫磁珠能特异性的吸附目的细菌，可以直接从样品中富集病原菌，减少前增菌过程，降低检测时间，提高检测率，能够基于已制备的兔抗沙门氏菌多克隆抗体制备免疫磁珠建立并优化实验方法以特异性捕捉中药中沙门氏菌。中沙门氏菌。中沙门氏菌。