qRT-PCR计算公式2–ΔΔCT(Livak)方法

qRT-PCR计算公式2–ΔΔCT（Livak）⽅法

当我们做到荧光定量实验时候，普遍采⽤操作简便的2–ΔΔCT 法。

前提条件：

1. 使⽤2–ΔΔCT 法之前，必须验证⽬标基因和参照基因的扩增效率。⽬标基因和参照基因扩增效率都接近100%，且相互间效率偏差在5% 以内。

计算⽅法：

⾸先，对所有的测试样和校准样本，⽤内参基因的CT 值归⼀⽬标基因的CT 值：

ΔCT(test) = CT(target, test) – CT(ref, test)

ΔCT(calibrator) = CT(target, calibrator) – CT(ref, calibrator)

其次，⽤校准样本的ΔCT 值归⼀试验样本的ΔCT 值：

玻璃丝包线>led闪光灯ΔΔCT = ΔCT(test) – ΔCT(calibrator)

最后，计算表达⽔平⽐率：

2–ΔΔCT = 表达量的⽐值

计算模板建⽴

⽽现在我们现在⽤的这款仪器QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System是⽆法计算的，所以需要⾃⼰⼿动计算，理解原理更容易操作。当然，此公式适合于所有2–ΔΔCT 法的荧光定量。

经我修改后计算模板：

Quantitative PCR calculation template for QuantStudio(TM) 7 Flex System_J.F.XIE(均值法) .xls

Extract code：hybr

案例展⽰

以吉玛⽣物公司试剂说明书案例为例，来计算 microRNA 相对于 U6 snRNA 的表达⽐率。

原始数据

计算步骤

硅胶气囊

计算步骤

运⽤计算模板，只需对应输⼊数据，即可⾃动计算出公式，结果如下：玩具直升机结构

模板计算

值得注意⼏点：

1. 数据修正：三个重复，如果CT值差异在0.2以外，则应剔除掉，所得结果均值会更加好。

2. 数据录⼊：我们在做PCR时候，已经排好版⾯，所以再挑出这些基因及内参时候，需要花费精⼒。简单点，可以将结果复制粘贴到新的excle⽂档，然后“筛选”，依次筛选出不同模板的“内参”、“靶标基因”的CT值，如下图筛选出的是EGFP对照处理组内参rpl32的CT值。

⼀⼀对应，所以在录⼊时候，⼀定要对应准确，每个孔都有Well Position，结3. 对应：做定量时候，同⼀模板做基因，⼜检测内参，所以关系是⼀⼀对应

简洁、对称、明了，便于后续分析。

合着384孔板来看，强烈建议在做排版设计之初，就做到简洁、对称、明了

如果在下机前，有部分孔扩增有问题，如双曲线，不要“剔除”，可以直接将其记录下来或者清空这个孔的CT（不是改为0），因为⼀

山楂提取物数据不对称，会⽐较⿇烦，容易出错。石墨保护套

旦“omit”之后，我们后续筛选时候，导致数据不对称

4. 计算表达值时候，会有⼀个⽣物重复做归⼀化，即2的0次⽅为1，案例中的calibrator。这个⾃⼰可以选，我习惯将排版的最开始的那⼀个做归⼀。

如果你想将所有表达基因，都可以展⽰在⼀张图⽚上，那所有值应该都与这个归⼀化值做⽐较。

数据筛选

可以看到，Well Position是⽐较整齐的，依次为GHIIJK，当筛选基因时候，也会⼀⼀对应，不会出错。

本文发布于:2024-09-21 11:11:46，感谢您对本站的认可！

标签：基因时候计算内参

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