食品质量与安全 王婉婷
摘要：采用免疫亲和柱—荧光光度法快速测定和微细柱快速检测方法测定牛乳中黄曲霉毒素 M1，方法具有准确、简单、快速、安全等优点，可以满足少量和批量样品的检测需要。 关键词：牛奶；黄曲霉毒素M1；快速检测
Rapid detecting aflatoxin m1 in milk
Student majoring in Food Quality and Safety WangWanting
Abstract:Aflatoxin M1 in milk are extracted and separated by immunoaffinity column and Micro column for rapid detection method
Key words: milk ;rapid detecting aflatoxin M1 ;aflatioxin M1 immunoaffinity column
一．前言
近代研究表明当奶牛食用饲料中含有Bl时,牛奶和其他乳制品会含有Ml［1］。黄曲霉毒素Ml的毒性和致癌性与黄曲霉毒素Bl的基本相似。由于牛乳及其制品是人类特别是婴儿的主要食品，因此各国对其限量的要求十分严格。我国及许多国家规定牛奶及奶制品中黄曲霉毒素Ml的含量不得超过0.5ug\kg；所以，快速、方便、准确的检测方法在牛奶的检测中十分重要，
二．主要检测方法
2.1免疫亲和柱—荧光光度法快速测定
2.1.1测定原理：试样经过离心、脱脂、过滤后，滤液经过键合有黄曲霉毒素Ml特殊抗体的免疫亲和柱净化，此抗体对黄曲霉毒素Ml具有专一的识别能力，黄曲霉毒素Ml键合在分离柱中的抗体上。用甲醇与水之比为10：90的混合液将免疫亲和柱上杂质除去；以甲醇与水之比为80：20 的混合液通过分离柱洗脱，加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度。衍生化后的洗脱液于荧光光度计中测定黄曲霉毒素Ml。 2.1.2仪器设备与试剂
系列真菌毒素专用荧光光度计（进口）；离心机（相对加速离心力大于2000g ）；空气压力泵；玻璃试管（12mm*75mm ，无荧光特性）玻璃纤维滤纸（直径11m ，孔径0.5um ）黄曲霉毒Ml免疫亲和柱进口）甲醇为液相谱级纯；氯化钠为分析纯；溴储备液（0.01﹪ ）：称取适量溴溶于水，配成质量分数为0.01﹪ 的储备液，避光保存溴水使用液（0.002﹪ ）：取10ml质量分数为0.01﹪ 的溴溶液加入40ml水混匀，于棕瓶中保存备用（需现用现配）。荧光光度计标定溶液（进口）：红标定管（内含0.00680g二水硫酸奎宁，20ml浓度为0.05mol\ml
硫酸溶液，此溶液相当于2ng\g 黄曲霉毒素Ml标准溶液；黄标定管内含0.00340g 二水硫酸奎宁，2ml浓度为0.05mol\ml硫酸溶液，此溶液相当于1ng\g
黄曲霉毒Ml标准溶液）；绿标定管（内含2ml浓度为硫0.05mol\ml酸溶液，此溶液不含黄曲霉毒素Ml）。
2.1.3分析步骤
(1)样品提取
液体牛乳及牛乳制品：量取50ml液体样品，加入1.0g 氯化钠，在离心机上以2000g离心10min，仔细地将用于牛奶分析的有效部分低层移取，不要扰动顶部脂肪层，将脱脂的牛奶以玻璃纤维滤纸过滤。
(2)净化
将免疫亲和柱连接于10ml玻璃针筒下。准确移取10.0ml上述澄清滤液注入玻璃针筒中，将空气压力泵与针筒连接，调节压力使溶液以约6ml\min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2-3空气通过柱体。以10ml甲醇与水之比为10:90的混合液清洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2-3空气通过柱体。准确加入1.0ml甲醇与水之比为80:20的混合液洗脱，流速为1-2ml\min，收集洗脱液于玻璃试管中，供检测用。
(3)测定
荧光光度计校准：在激发波长360nm ，发射波长50nm条件下，以绿标定管调节荧光光度计的荧光强度值读数为0.0；以红标定管调节荧光光度计的荧光强度值读数为2.0；以黄标定管验证荧光光度计的荧光强度值读数应该为1.0±0.2 。
磁卡门禁机样液测定：取上述洗脱液加入1.0ml质量分数为0.002﹪溴溶液，于荧光光度计中测定黄曲霉毒素Ml含量。
(4)结果计算
荧光光度计测定结果按下式计算
X=cV/m (10）
式中：X为试样中黄曲霉毒素Ml含量，（ug\kg ）；c为荧光光度计中读取的样液中黄曲霉毒素Ml 的浓度（ng\ml）；V为样液最终定容体积（ml）；m为最终样液所代表的试样量（g）。
2.2微细柱快速检测方法
的Ml微细柱快速检测方法,检测范围大约为0.2ug/kg,能够应于工厂,Holaday于1969 年首先引人了微细柱技术［2］。随着这技术的发展,微细柱技术得到了若干改进。Romer 等对微细柱技术的进展作了很好的概述［3］。本方法对此技术的改进,在于减少每
次洗涤玻璃器皿的时间,从而减少了费用,并减少Ml带到下一个样品中去。
2.2.1仪器设备
(a).观察橱—层分离小室为C一6型,免蒸加气砖或类似装置,装有长波紫外灯。
(b).真空源—水喷射泵或小真空泵。
(c).分液漏斗—125ml、圆筒形、带刻度。
(d).刻度量筒—10ml容量、混合型的聚乙烯塞。
(e).锥形烧瓶—过滤型、250 ml容量、边上有刻度、带有中间有小孔的8 个 橡(f).皮塞(以便联结微细柱与锥形瓶)、联结锥形瓶到真空源的橡皮管。
(g).布氏漏斗载有9cm 滤纸、并装有橡皮调节阀。
(h).培养管—125x16mm。
(i).吸管—5ml。
(j).吸管填块—橡皮。过滤基—9cm、玻璃纤维
(k).微细柱—180mm*直径5.5mm
2.2.2实验试剂
(a)盐溶液—溶解700克NaCI和人脸识别门700克ZnSo4·7H20 在1.5升水中。这些量是略微超过盐在水中的饱和点的。
(b)混合助滤剂—硅藻土一吸附镁(1 +1 )
(c)甲苯—ACS级。
(d )甲苯-甲醇—甲苯-ACS级甲醇(80十20 )。(e)M1标准液—M1标谁液购自德国
2.2.3操作程序
在刻度量筒里加入6一8克混合助滤剂到30ml牛奶中。如果是测试生牛奶样品,必须在测试前将奶油同牛奶的其它部份充分混和。( 测试少量再生奶粉样品没有遇到困难,但必须附带测
试这一产品,以保证进展顺利。而大多数测试是用均质的生牛奶做的。塞好圆筒,剧烈混和内容物2-3秒。加30ml盐溶液到混合物中,再一次塞好圆筒,剧烈震摇2-3秒。在布氏漏斗里过滤45ml混和液去掉钙。添加4Oml滤出液在分液漏斗中,和5ml甲苯在一起。在上漏斗中,混和内物3或4次。但不能混和得太厉害,造成两次分离。排弃下层,转移上层( 甲苯) 到培养试管中。把橡皮塞插人带小孔橡皮塞的锥形烧瓶中,用矾土终止下端( 底一侧一上)。加2ml甲苯一甲醇液到微细柱中,靠真空吸入。在真空情况下,倒转柱( 矾土在上端) 加入3ml甲苯萃取液,并吸入。然后,加lml甲苯一甲醇,吸人,移置微细柱于观察橱内。Forlish-Na2So4制卡设备界面现兰带表明至少存在0.2ug/kg Ml。比较几个含0.2ug/kg检样的微细柱结果与薄层谱( TLe) 结果,可断定检测范围。用3ml甲苯萃取液少量地添至兰带明显可见,可做到某些定量测定。
3．防治方法
1.更换饲（草）料。 立即停止使用原饲草饲料，改喂单一无霉变的粗饲料，如稻草和花生秧，饲喂1实验室自动清洗机周。
2.恢复精料，使用脱霉剂。1周后，使用精料，并加优质的脱霉剂，标准为量，即奶
牛牛奶中超标的防治技术每天采食精料总量的1.5‰～机器人移动底盘2‰，再经饲喂1周后，标准改为预防量，即奶牛每天采食精料总量的1‰，并长期使用。
3.恢复青贮料。在脱霉剂改为预防量的同时，添加无霉变的青贮料。
4.改善环境卫生。 彻底打扫牧场周围环境卫生，及时将牛粪等垃圾运出牧场，保持牧场清洁卫生。
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