Western-blot试验技术
Western-blot试验技术概论它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无需对
靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题。具有从混杂抗原中检测出 特定抗原，或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白质反应均一性，固相膜保存时 间长等优点。被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学的研究。溶解蛋白策略1使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来 ，但这可能导致免疫反应性的丢失。2采用温和的条件以助于保持蛋白质的天然状态，但这造成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。机械破碎细
胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细胞表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵抗力，变性蛋白比天然蛋白更容易降解。往往可
以根据靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性质来调整提取的条件。为尽可能减少可能出现的问题，可设法采用多克隆抗血清或多种单克隆抗体的混
合物，因为他们可与某一蛋白的多种形式起反应。溶解方法溶解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质：1表达靶蛋白的细菌一般
直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解。2酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后制备提取液。3哺乳动物组织通常可以机械分散并直接
溶于SDS凝胶加样缓冲液。4哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶抗原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓冲液裂解。
细胞准备用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮子刮下细胞，由于染体DNA的释放，溶液变得很粘稠。吸入1.5ml离心管。
超声打碎染体DNA,直至溶液不粘为止。4度，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。
有必要时重复上一步骤。上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可将上清转入另一Eppendorf-80°C保存注意事项带隙基准
细胞裂解液的量超声的频率，时间，次数。插得深不起泡沫。检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的SDS－PAGE的一个孔大
约上100ug的总蛋白。只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可被检测。未知蛋白应同时作阳性对照。主要试剂R
IPA（华舜公司）苯PMSF（华舜公司）丙烯酰胺（Amresco公司）双丙烯酰胺（Amresco公司）丽春红染料 （华舜公司）Tween20（Amresco公司）过硫酸铵（Sigma公司）四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司）硝酸纤
维素膜（Amersham公司）考马斯亮兰（Fluka公司）兔抗大鼠Glut1多克隆抗体（SantaCruz公司）Phot
otope-HRPWesternBlotDetectionSystem（CellSignalingTechnology
公司）仪器与设备低温超速离心机（Eppendorf公司）分光光度计（Eppendorf公司）Thermomixer（
Eppendorf公司）电泳仪（Bio-Rad公司）垂直式电泳槽（Bio-Rad公司）硝酸纤维素膜电转系统（Bio-Ra
d公司）配制试剂10×电泳Buffer称取Tris-base30.3克
glycine144克加去离子水，定容至1000ml
SDS10克1.5MTris.HClPH8.8称取
18.15克Tris，加60mlddH2O溶解，调PH至8.8，定容100ml0.5MTris.HClPH6.8
称取6.0克Tris，加60mlddH2O溶解，调PH至6.8，定容100ml转膜缓冲液称取
3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml，临用前加200ml甲醇
10：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml。配制试剂30％Acry
-
Bis29克丙烯酰胺＋1克双丙烯酰胺，加ddH2O100ml配成，避光4℃保存10％过硫酸胺，新鲜配制，<1weekwww.99ctct
0.1克过硫酸胺加ddH2O1ml配成，4℃保存封闭试剂10×TBS（应用液：1×TBS）10×TBS：取
24.2克Tris－Base80克氯化钠用800mlddH2O溶解后，用HCl调PH至7.6，定容至1000ml1×
TBS：取10×TBS50ml，稀释至500ml，临用前加0.1％Tween20，500ul。配制试剂4×SDSSa
纳米金粉
mpleBuffer2.4克TrisHCL，溶解在30ml水中，调pH6.88克SDS0
.4克溴酚兰定容至100ml40ml甘油
10mlDTT贮存液1mol/LDTT贮存液：0.01mol/L乙酸钠20ml3.09克DTT过滤除菌后-20℃保
存，分装成1ml。考马斯亮兰染液：45ml甲醇45ml水
用Whatman滤纸过滤，去除颗粒状物质10ml冰乙酸0.25克考马斯亮兰R250抗
体选择一种免疫球蛋白可优先识别其靶表位的某一特定构象（例如变性构象或天然构象）。并非所有的单克隆抗体都适合作为探针用于WETER
N-BLOT，因为这一实验中靶蛋白是彻底变性的。多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物，通常对其特异性、亲和力以及浓度
都一无所知。因而不可能预言用特定多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白上的不同抗原表位的效果。设置对照：1不与靶蛋白反应的
抗体（即免疫前血清或非相关单克隆抗体）2样品对照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的制品选用抗变性蛋白的高滴度多克隆
立体声音抗血清或单克隆抗体混合物为佳。实验步骤配胶制胶先用1ml头小心铺10%分离胶，上加少许异丙醇，待分离胶干凝后，倒去
异丙醇，用水洗去多余未聚合的胶，滤纸吸干。再铺4%积层胶，注意不要产生气泡，斜插上梳子，待胶干后备用，拔去梳子。上样，所有上样孔
均加样，没有样本，用上样缓冲液代替。100V，溴酚兰走到分离胶底部后，1.5h后电泳结束。实验步骤转膜小心取下凝胶，
植物伟哥把预先在转膜缓冲液中平衡过的Whatman滤纸及硝酸纤维素膜切成与凝胶同样大小，按次序叠放在一起，在4度100V电压转膜1H,取出
硝酸纤维素膜，右上角切去以作标记，丽春红染，可见多条粉红条带，再用TBST漂洗至膜发白。封闭称取脱脂奶粉1克，用1×TB
S溶解到20ml，使脱脂奶粉浓度为5％。将硝酸膜浸在20ml封闭液中，室温摇2h后。实验步骤一抗杂交孵育将一抗用含5
%脱脂奶粉的1×TBST溶液稀释，使抗体浓度为1:1000；将封闭过的膜放在一抗稀释液中，4度过夜；而后吸弃一抗稀释液，用1×TB
ST洗3次，每次5min。二抗孵育二抗杂交孵育：将辣根过氧化物酶连接的二抗用含5%脱脂奶粉的1×TBST溶液稀释，使浓度为1:2
000，并加入辣根过氧化物酶连接的抗生物素抗体（浓度为1:1000），将膜置于二抗稀释液中，室温振荡孵育1h；而后吸弃二抗稀释液，
用1×TBST洗3次，每次5min。实验步骤显影：将膜置入10mlLumiGLO溶液中（10mlLumiGLO溶液
配方为：0.5ml20×LumiGLO、0.5ml20×Peroxide、9.0mlMilli-Qwater），室温轻摇1
分钟，注意避光操作；在暗室中剪下与膜同样大小的胶片，压在暗盒中，约1min；将胶片放在显影液中洗1-5min；水冲洗；定影液中洗2
-5min；水冲洗，可在相应位置见到目的条带。疑难杂证没有注明可以用来做westernblot的一抗，可以用来做west
ernblot吗？不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于we
sternblotting，因为在westernblotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变
性时被破坏。疑难杂证做western每次只加一种一抗，请教有人同时加两种或者多种一抗的吗？最好还是不要同时加
两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗
、二抗，ECL显、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显、压片、洗片。曾经做过Western在同
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