芬布芬在制备杀灭革兰氏阴性菌药物中的应用

1.本发明属于杀灭革兰氏阴性菌技术领域，具体涉及芬布芬增强抗生素杀灭革兰氏阴性细菌的应用。

背景技术：

2.随着抗生素在世界范围的广泛使用，产生了越来越多的抗性菌和耐药菌，由于抗生素研发周期较长，目前细菌感染依然是医学领域的一大难题。细菌可以定植于患者的不同器官，从而导致各种感染性疾病，包括菌血症、脑膜炎、腹膜炎、尿路感染等。多粘菌素以前因其肾毒性和神经毒性而被禁止临床使用，现在正被用作耐药细菌感染的最后手段，联合使用抗菌药物也被认为是根除导致慢性和反复感染的耐药细菌的有效方法，因此开发安全有效的抗生素佐剂是非常有前景的细菌感染的有效途径。
3.芬布芬目前被用作一种长效非甾体抗炎镇痛药物，主要用于类风湿性关节炎、骨关节炎、关节强硬性脊椎炎和痛风等症，其作用机理是抑制环氧酶活性进而抑制前列腺素合成。芬布芬作为抗炎镇痛药物已上市多年，经过毒理和药理检测，患者易于耐受，不良反应较小，因此可以作为安全有效的抗生素佐剂。

技术实现要素：

4.本发明验证了芬布芬能够通过抑制二氢叶酸还原酶活性促进杀菌，并且芬布芬能够提升细菌对抗生素敏感性以达到杀灭抗性菌、降低耐药菌产生的效果。
5.基于本发明的实验结论，本发明首要目的是提供芬布芬在制备杀菌药物中的应用、同时还提供一种杀菌组合物以及一种杀菌药物和一种杀菌方法。
6.本发明目的之一是提供一种芬布芬在制备杀菌药物中的应用，所述杀菌药物是针对革兰氏阴性菌的药物。
7.优选的，所述革兰氏阴性菌为敏感型大肠杆菌和耐药型大肠杆菌。
8.优选的，所述耐药型大肠杆菌为耐β-内酰胺类大肠杆菌。
9.优选的，所述杀菌药物包括多粘菌素b。
10.本发明还提供一种杀菌组合物，针对的细菌为革兰氏阴性菌，其成分为抗生素和芬布芬；其中，芬布芬有效浓度不低于512μg/ml。
11.优选的，所述抗生素为多粘菌素b。
12.本发明还提供一种杀菌药物，针对的细菌为革兰氏阴性菌，所述杀菌药物包括所述杀菌组合物以及药学上可接受的辅料和载体。
13.本发明还提供一种杀灭革兰氏阴性菌的方法，该方法中所使用药物为所述杀菌组合物与药学上可接受的辅料制成的制剂。
14.本发明的有益效果：
15.1.多粘菌素b因其肾毒性和神经毒性限制了其临床使用剂量，芬布芬能够使多粘菌素b的杀菌效果增强，因此降低其使用剂量也可以达到效果，扩大其临床应用范围，
并且芬布芬能降低耐药菌产生。
16.2.芬布芬作为已上市药物，机体接受度高，不良反应小，研发成本低。
附图说明
17.图1多粘菌素b联合芬布芬处理敏感菌和抗性菌的存活率图；
18.(a)大肠杆菌atcc 25922在不同浓度的多粘菌素b以及有无512μg/ml芬布芬处理24小时的细菌存活率结果。
19.(b)大肠杆菌atcc 35218在不同浓度的多粘菌素b以及有无512μg/ml芬布芬处理24小时的细菌存活率结果。
20.图2多粘菌素b联合芬布芬处理敏感菌和抗性菌的时间杀灭曲线图；
21.(a)指数生长期的大肠杆菌atcc 25922在不同浓度的多粘菌素b以及有无512μg/ml芬布芬处理0、3、6、9、24小时的细菌存活数结果。
22.(b)指数生长期的大肠杆菌atcc 35218在不同浓度的多粘菌素b以及有无512μg/ml芬布芬处理0、3、6、9、24小时的细菌存活数结果。
23.图3不同浓度芬布芬对于二氢叶酸还原酶的酶促反应速率抑制结果的双倒数曲线。
具体实施方式
24.以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
25.实施例1
26.标准敏感菌株大肠杆菌atcc 25922和标准耐β-内酰胺类菌株大肠杆菌atcc 35218的最小抑菌浓度测定。
27.本实验中的抗生素代表药物选用多粘菌素b，使用液体mh培养基将多粘菌素b进行2倍系列梯度稀释，将稀释后的多粘菌素b溶液加入到灭菌后的96孔板中，再加入终浓度约为1.0
×
107的菌液，在37
°
培养24小时，用酶标仪测定细菌培养物在od
600
处的吸光度，确定最小抑制菌株生长的浓度mic，结果如下表所示：
28.表1最小抑菌浓度mic测定(μg/ml)
29.抗生素atcc25922atcc 35218多粘菌素b22
30.实施例2
31.药敏实验
32.进行棋盘实验，用mh液体培养基按照2倍梯度稀释配好7个浓度的多粘菌素b溶液(0、0.125、0.25、0.5、1、2、4μg/ml)和512μg/ml的芬布芬溶液，加入到96孔板中，再加入终浓度约为1.0
×
107的大肠杆菌atcc 25922或atcc 35218菌液，在37
°
培养24小时，用酶标仪测定细菌培养物在od
600
处的吸光度，确定各组药物的杀菌效果。结果如图1所示：512μg/ml的芬布芬能够使多粘菌素b的抑菌效果提升4倍(mic由2μg/ml降低至0.5μg/ml)。
33.多粘菌素b九肽(pmbn)是一种阳离子环肽，是经酶裂解多粘菌素b而产生的衍生
物，与多粘菌素b相比，pmbn毒性低，缺乏杀菌活性，仍具有破坏革兰氏阴性菌外膜的能力。经实验发现浓度高至40μg/ml的pmbn本身也不具有抑菌活性，但10μg/ml的pmbn与512μg/ml芬布芬联合使用时，出现抑菌活性，实验结果充分说明芬布芬能够增强抗生素的杀菌效果。
34.实施例3
35.时间杀灭曲线实验
36.为了产生指数生长阶段的菌，将大肠杆菌atcc 25922或atcc 35218的过夜培养物在新鲜的lb液体培养基中稀释后，培养约3小时，达到指数阶段。加入芬布芬、多粘菌素b、芬布芬和多粘菌素b的组合物，并在37
°
下摇动培养。在0、3、6、9、24小时使用平板计数法记录菌落数。结果如图2所示：4μg/ml的多粘菌素b不能完全杀灭大肠杆菌atcc25922和atcc 35218，但2μg/ml多粘菌素b和512μg/ml芬布芬的组合物可以完全杀灭以上两种大肠杆菌。
37.实施例4
38.抑制酶活性的实验
39.在含有2.5mg/ml牛血清白蛋白的缓冲液中制备0.43nm细菌二氢叶酸还原酶(ecdhfr)，以确保酶的稳定性。反应前将nadph和ecdhfr在30
°
水浴锅预先孵育2分钟，以消除配体结合时可能出现的滞后效应。二氢叶酸(dhf)和芬布芬在反应开始前加入ecdhfr和nadph混合物中并搅拌30s混匀。反应终浓度分别为12.5-200μm dhf、0-80μm芬布芬、60μm nadph和0.43nm ecdhfr，反应时间为10min。使用紫外分光光度计检测反应体系在340nm波长处的吸光度变化，酶促反应速率(v)计算方式为每减少0.05od/5min为1u，绘制酶促反应抑制曲线如图3所示：根据化合物抑制常数(ki)计算公式得到芬布芬抑制细菌二氢叶酸还原酶的ki＝12.44
±
7.77μm。

技术特征：

1.芬布芬在制备杀灭革兰氏阴性菌药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌为敏感型大肠杆菌和耐药型大肠杆菌。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述耐药型大肠杆菌为耐β-内酰胺类大肠杆菌；所述杀灭革兰氏阴性菌药物为多粘菌素b。4.一种杀菌组合物，其特征在于，针对的细菌为革兰氏阴性菌，其成分为抗生素和芬布芬；其中，芬布芬有效浓度不低于512μg/ml。5.根据权利要求4所述的杀菌组合物，其特征在于，所述抗生素为多粘菌素b。6.一种杀菌药物，其特征在于，针对的细菌为革兰氏阴性菌，其包括权利要求4或5所述的杀菌组合物以及药学上可接受的辅料和载体。7.一种杀灭革兰氏阴性菌的方法，其特征在于，该方法中所使用药物为权利要求4或5所述的杀菌组合物与药学上可接受的辅料制成的制剂。

技术总结

芬布芬在制备杀灭革兰氏阴性菌药物中的应用，属于杀灭革兰氏阴性菌技术领域，本发明公开了芬布芬具有增强抗生素对于革兰氏阴性菌杀菌效果的作用，本发明设计实验证明了芬布芬能够抑制细菌二氢叶酸还原酶的活性，从而影响细菌的核酸代谢过程。芬布芬本身不具有抑菌活性，但当其与多粘菌素B联合使用时，能够增强多粘菌素B对于大肠杆菌的杀菌效果，并且能够使不具有杀菌作用的多粘菌素B九肽产生杀菌效果，充分验证了芬布芬能够增强对于革兰氏阴性菌的抗生素杀菌效果。菌的抗生素杀菌效果。