具有改善肠道微生态性能和增强肿瘤免疫检查点抑制剂效果的益生菌复合制剂及应用

1.本发明涉及一种具有改善肠道微生态性能和增强肿瘤免疫检查点抑制剂效果的益生菌复合制剂及应用，属于益生菌制剂技术领域。

背景技术：

2.癌症是一种威胁人类生命健康最重大的疾病之一，难度高，死亡率高，会给患者及其家庭带来沉重的负担。近年来，全球癌症患者激增。最新数据表明，2021年全球新发癌症病例超2000万，癌症死亡病例超1000万。虽然目前手术、化疗、放疗和生物等手段取得了重大进步，但是晚期恶性肿瘤的病死率仍然很高。很多肿瘤的初始临床效果良好，但随着时间的延长，肿瘤往往会产生耐药性，且容易复发，为临床带来严峻挑战。
3.近年来，免疫突飞猛进，机体免疫系统不仅有免疫监视作用，在某些阶段还可以促进肿瘤免疫逃逸，在肿瘤的发生、发展中发挥着重要的作用。以免疫检查点为靶点的抑制剂(immune checkpoint inhibitor，ici)作为一种新型的免疫药物，在一些晚期恶性肿瘤中具有广阔的应用前景。目前有3类ici批准上市，包括程序性死亡分子1(programmed death 1，pd 1)、程序性死亡配体1(programmed death ligand 1，pd l1)以及细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic t lymphocyte associated protein 4，ctla 4)抑制剂，ici自问世以来用于多种肿瘤，在20％30％的患者取得了肯定的疗效，部分晚期肿瘤患者经过ici后甚至完全缓解，能够长期生存，成为肿瘤历史上重要里程碑。然而不幸的是，大部分肿瘤患者对ici的初始响应率极低，或在初始后很快出现继发耐药，这大大限制了ici的临床应用和推广。因此，探索克服ici耐药的策略，进一步提高ici响应率，成为肿瘤学领域的热点和难点问题。
4.肠道菌是寄居在人体肠道内的正常微生物落，对宿主的生长发育、营养代谢及免疫稳态都有重要作用。肠道菌间保持共生或拮抗关系，可在肠道内形成一个动态平衡的生态系统，维持肠道屏障稳态，调控代谢、炎症和免疫。特定肠道菌作为促癌或抑癌因素，影响肿瘤的发生、发展和转移。同时其可从多个方面影响药物的药代动力学、抗癌活性和毒性，对抗肿瘤产生重要影响。近年来，肠道菌与肿瘤的免疫的相关研究取得了极大的进展，越来越多的证据表明，肠道菌种类及丰度会对肿瘤免疫疗效产生重要影响。
5.既然肠道菌影响了ici的效果，那么我们可以通过调整肠道菌来提高ici的抗肿瘤效果，简单实用的方法包括调节饮食、口服益生菌和粪菌移植等来调节肠道菌。在前期的研究中，我们利用乳酸菌发现其能够显著增强pd-1抑制剂结直肠癌模型的响应率和效果(gut microbes.2022 jan-dec；14(1):2046246.)。更有趣的是，我们还发现膳食纤维等益生元能够显著改善小鼠的肠道微生态，而经益生元重塑的肠道微生态对于pd-1抑制剂的效果具有显著的促进作用(theranostics.2021 feb 19；11(9):
4155-4170.)。如今肠道菌与免疫的关系是基础和临床研究的难点和热点。但是，除了我们前期报道的乳酸菌，关于其他益生菌是否也能够显著增强pd-1抑制剂结直肠癌模型的响应率和效果未为可知，目前也没有关于益生菌联合膳食纤维等益生元在ici中使用方法和制剂的相关报道。

技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种新的益生菌复合制剂，它包括有婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)和短双歧杆菌(bifidobacterium breve)三大类益生菌，同时还添加了膳食纤维果胶。该组合物可以适应更广泛的人的不同肠道特征，安全可靠，作用效果明显，能够有效增强ici的效应。为肿瘤的免疫提供了新的策略和思路。
7.为了实现上述目的，本发明提供了一种具有改善肠道微生态性能和增强肿瘤ici效果的益生菌复合制剂，该复合制剂包括益生菌和益生元，所述益生菌为双歧杆菌。
8.优选地，所述益生菌包括以重量份数计的婴儿双歧杆菌bifidobacterium infantis 20-40份、长双歧杆菌bifidobacterium longum 20-40份和短双歧杆菌bifidobacterium breve 20-40份。
9.优选地，所述益生菌复合制剂中包含5～20wt％的益生元。
10.优选地，所述的益生元选自菊糖、寡糖、低聚果胶、低聚果糖、非降解性淀粉、乳蔗糖、乳果糖、乳糖醇和麦芽糖醇中的至少一种；所述寡糖选自半乳寡糖、大豆寡糖和龙胆寡糖中的至少一种。
11.更优选地，所述的益生元为低聚果胶。
12.优选地，所述低聚果胶：婴儿双歧杆菌：长双歧杆菌：短双歧杆菌的比例为1g：106～10
13
cfu：106～10
13
cfu：106～10
13
cfu。
13.本发明还提供了上述的益生菌复合制剂在制备改善肠道微生态性能和/或提高具有ici抗性的肿瘤疗效的产品中的应用。
14.优选地，所述的产品包括口服药物制剂或食品，所述肿瘤包括结直肠癌。所述的口服药物制备包括冻干剂、粉剂、粒剂、片剂、软凝胶胶囊剂或悬浮剂，所述的食品包括奶粉、饮料或饼干。
15.本发明还提供了上述的益生菌复合制剂联合免疫检查点抑制剂在制备具有ici抗性的肿瘤的药物中的应用。
16.优选地，所述的免疫检查点抑制剂为pd-1抑制剂(bioxcell，货号：bp0033)，所述的肿瘤为结直肠癌。
17.本发明还提供了上述的益生菌复合制剂在纠正荷瘤小鼠肠道菌的紊乱，改善其多样性和组成中的应用，以及在具有ici抗性的肿瘤模型中的应用。所述的荷瘤小鼠和肿瘤模型为结直肠癌小鼠模型。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
19.(1)本发明的膳食纤维益生菌复合制剂以婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)和短双歧杆菌(bifidobacterium breve)为原料，各菌种之间相互作用，协同增效，有效调节肠道菌、改善机体免疫状态、提
高肿瘤的ici效应，且对正常组织器官无不良影响；相对于前期的研究成果，本发明开拓了益生菌用于增强肿瘤的ici效应时的选择种类；
20.(2)本发明在益生菌组合中添加膳食纤维低聚果胶等益生元，能够显著改善益生菌活性、提高其在模拟胃酸环境中的存活率，同时能够有效降低肠道内有害菌大肠杆菌、肠球菌等的数量，进而在肠道能释放益生菌，促进益生菌增殖，改善肠道微生态的性能。
附图说明
21.图1展示了益生菌复合制剂纠正结肠癌小鼠的肠道菌紊乱，改善菌α多样性；a：菌种类统计分析；b：shanon指数分析；c：ace指数分析；d：chao1指数分析；*p《0.05，两组间经统计分析具有显著性差异；ns：两组间经统计分析无显著性差异；
22.图2展示了益生菌复合制剂纠正结肠癌小鼠的肠道菌紊乱，改善菌β多样性；a：基于bray-curtis相异系数的β多样性分析；b：基于jaccard相异系数的β多样性分析；
23.图3展示了益生菌复合制剂纠正结肠癌小鼠的肠道菌紊乱，改善菌落的组成；a：门水平上分析了各组肠道菌的具体变化；b：科水平上分析了各组肠道菌的具体变化；
24.图4展示了益生菌复合制剂提高具有ici抗性的肿瘤模型的效果；a～d分别为对照组、pd-1抑制剂处理组、益生菌制剂处理组以及pd-1抑制剂联合益生菌制剂处理组小鼠肿瘤体积变化；e：各处理组小鼠肿瘤体积对比分析；f：各处理组小鼠体重变化；*p《0.05，两组间经统计分析具有显著性差异；**p《0.01，两组间经统计分析具有显著性差异；ns：两组间经统计分析无显著性差异；
25.图5展示了益生菌复合制剂对肿瘤模型的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)无不良影响，具有较高的安全性。
具体实施方式
26.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
27.以下实施例中所涉及到的微生物菌种和益生元均可通过市购获得，亦可通过现有技术进行培养和生产。
28.实施例1：益生菌复合制剂的制备
29.分别选取下述菌株的各0.3克的冻干益生菌粉，并混合均匀(其活菌数均为500亿/克)：婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)和短双歧杆菌(bifidobacterium breve)。再在上述0.9克的益生菌混合物中分别加入0.1克的膳食纤维低聚果胶，得到1克的可作为益生菌膳食补充剂的实验成品(1g成品中，活菌总数相当于450亿/克)，用于下述小鼠动物体内实验。
30.实施例2：益生菌复合制剂用于纠正荷瘤小鼠模型的肠道菌紊乱
31.细胞培养：以10cm hyclone细胞培养皿进行细胞培养，将mc38细胞以106/ml种于10ml含10％胎牛血清的rpmi1640细胞培养基中，3天后待细胞长满80％培养皿进行细胞传代及后续实验。
32.小鼠结直肠癌模型的构建：收集培养6天的mc38细胞，以pbs重悬细胞制成1.0
×
108/ml的细胞悬液。选用6-8周龄大小的雌性c57bl/6小鼠，按每只小鼠5.0
×
105个细胞进行皮下注射，大约1周后成瘤，成瘤率是100％。成瘤后，每3天测量肿瘤直径(长径及短径)1次，
小鼠肿瘤体积计算公式：v＝0.5
×
长径
×
短径
×
短径。在肿瘤体积约为150～200mm3时开始给药干预。
33.肠道菌紊乱荷瘤小鼠模型的制备与饲养：实验组小鼠用广谱抗生素组合灌胃3天，可建立肠道菌紊乱的小鼠模型，对照组用生理盐水灌胃，剂量和方法同抗生素。本实验小鼠饲育于无特定病原体(specific pathogen free，spf)级的动物房中，饲养温度为20～23℃，湿度为40％～70％，12h光照：12h黑暗。饲料和垫料均经过60co-γ、50kgy射线辐照灭菌，饮水、鼠笼和饮水瓶等经过高温高压灭菌后方能使用。
34.实验分组与处理：本研究实验分组包括空白对照组、益生菌复合制剂组(每g益生菌水溶液中，活菌数450亿)，每组6～8只小鼠。第30天，收集各组小鼠粪便样本后，颈椎脱臼处死，然后将小鼠固定于小动物手术台上，全身酒精消毒后，取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、结肠及肿瘤组织，并用预冷的pbs反复冲洗干净后置于福尔马林溶液中保存。
35.实验结果：为了确定益生菌复合制剂是否以及如何影响荷瘤小鼠的肠道菌，我们在肿瘤接种后第30天采集各组小鼠的粪便进行16s rdna测序分析。首先，对各组的肠道菌的α多样性进行分析，结果显示与对照组相比，益生菌复合制剂处理组的shannon和ace指数显著增加(图1)。基于bray-curtis和jaccard相异系数的β多样性分析表明，各组的肠道微生物落出现明显的分离(图2)。此外，我们还在不同的分类水平上分析了各组肠道菌的具体变化。在门水平上，对照组中以拟杆菌门(bacteroidetes)相对丰度最多，而益生菌复合制剂处理组中以厚壁菌门(firmicutes)相对丰度最多(图3a)。在科水平上，益生菌复合制剂处理的小鼠表现出向均衡肠道菌微生态进化的趋势(图3b)。例如，罗斯氏菌属(roseburia)、乳杆菌科(lactobacillaceae)、普拉梭菌属(faecalibacterium)、双歧杆菌科(bifidobacteriaceae)、韦荣球菌科(erysipelotrichaceae)和瘤胃球菌科(ruminococcaceae)等微生物明显增加，而这些类是产生短链脂肪酸的主要微生物，与肠道微生态系统的平衡密切相关。属水平的差异分析表明，益生菌复合制剂处理组和对照组之间具有显著差异，瘤胃球菌属(ruminococcus)、普拉梭菌属(faecalibacterium)和霍尔德曼氏菌属(holdemania)等在益生菌复合制剂处理组显著增加(图3b)。文献报道，这些菌可产生具有免疫调节功能的短链脂肪酸，促进肠道内环境的稳态。综上数据表明，益生菌复合制剂可以提高小鼠的肠道菌的丰富度和多样性，促进小鼠形成稳健的肠道微生态。
36.实施例3：益生菌复合制剂用于具有ici抗性的肿瘤模型的效果
37.细胞培养：以10cm hyclone细胞培养皿进行细胞培养，将mc38细胞以106/ml种于10ml含10％胎牛血清的rpmi1640细胞培养基中，3天后待细胞长满80％培养皿进行细胞传代及后续实验。
38.小鼠结直肠癌模型的构建：收集培养6天的mc38细胞，以pbs重悬细胞制成1.0
×
108/ml的细胞悬液。选用6～8周龄大小的雌性c57bl/6小鼠，按每只小鼠5.0
×
105个细胞进行皮下注射，大约1周后成瘤，成瘤率是100％。成瘤后，每3天测量肿瘤直径(长径及短径)1次，小鼠肿瘤体积计算公式：v＝0.5
×
长径
×
短径
×
短径。在肿瘤体积约为150～200mm3时开始给药干预。
39.肠道菌紊乱荷瘤小鼠模型的制备与饲养：实验组小鼠用广谱抗生素组合灌胃三天，可建立肠道菌紊乱的小鼠模型，对照组用生理盐水灌胃，剂量和方法同抗生素。本实验小鼠饲育于spf级的动物房中，饲养温度为20～23℃，湿度为40％～70％，12h光照：12h黑
暗。饲料和垫料均经过60co-γ、50kgy射线辐照灭菌，饮水、鼠笼和饮水瓶等经过高温高压灭菌后方能使用。
40.实验分组与处理：本研究实验分组包括空白对照组、pd-1抑制剂处理组、益生菌制剂处理组(每1g益生菌水溶液中，活菌数450亿)和pd-1抑制剂联合益生菌复合制剂处理组，每组6-8只小鼠。第30天，收集各组小鼠粪便样本后，颈椎脱臼处死，然后将小鼠固定于小动物手术台上，全身酒精消毒后，取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、结肠及肿瘤组织，并用预冷的pbs反复冲洗干净后置于福尔马林溶液中保存。
41.实验结果：结果见图4。单独补充益生菌复合制剂对肿瘤生长无明显影响，而益生菌复合制剂+pd-1抑制剂(bioxcell，货号：bp0033)联合使用可显著抑制肿瘤生长，且效果优于单独使用pd-1抑制剂(图4a-d)。各组小鼠肿瘤体积的统计分析也证实了这一结果(图4e)。此外，在整个实验过程中，各组小鼠的体重都保持了稳定的增长，各组之间的体重亦无显著差异(图4f)。
42.实施例4：益生菌复合制剂与ici联合应用具有较高的安全性
43.为了研究益生菌复合制剂联合pd-1抑制剂在荷瘤小鼠中的安全性，我们对小鼠的主要脏器，包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏以及肾脏进行了he染分析，发现各个脏器未见形态学和病理学损伤(图5)，这提示益生菌复合制剂+pd-1抑制剂联合应用对正常组织无明显的不良影响。综上所述，本发明的益生菌复合制剂可显著增强pd-1抑制剂的疗效，且具有较高的安全性。
44.上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种具有改善肠道微生态性能和增强肿瘤免疫检查点抑制剂效果的益生菌复合制剂，其特征在于，该复合制剂包括益生菌和益生元，所述益生菌为双歧杆菌。2.如权利要求1所述的具有改善肠道微生态性能和增强肿瘤免疫检查点抑制剂效果的益生菌复合制剂，其特征在于，所述的益生菌包括以重量份数计的婴儿双歧杆菌bifidobacteriuminfantis 20-40份、长双歧杆菌bifidobacterium longum20-40份和短双歧杆菌bifidobacterium breve 20-40份。3.如权利要求2所述的具有改善肠道微生态性能和增强肿瘤免疫检查点抑制剂效果的益生菌复合制剂，其特征在于，所述益生菌组合物中包含5～20wt％的益生元。4.如权利要求3所述的具有改善肠道微生态性能和增强肿瘤免疫检查点抑制剂效果的益生菌复合制剂，其特征在于，所述的益生元选自菊糖、寡糖、低聚果胶、低聚果糖、非降解性淀粉、乳蔗糖、乳果糖、乳糖醇和麦芽糖醇中的至少一种；所述寡糖选自半乳寡糖、大豆寡糖和龙胆寡糖中的至少一种。5.如权利要求4所述的具有改善肠道微生态性能和增强肿瘤免疫检查点抑制剂效果的益生菌复合制剂，其特征在于，所述的益生元为低聚果胶。6.如权利要求5所述的具有改善肠道微生态性能和增强肿瘤免疫检查点抑制剂效果的益生菌复合制剂，其特征在于，所述低聚果胶：婴儿双歧杆菌：长双歧杆菌：短双歧杆菌的比例为1g：106～10
13
cfu：106～10
13
cfu：106～10
13
cfu。7.权利要求1～6中任意一项所述的益生菌复合制剂在制备改善肠道微生态性能和/或提高具有免疫检查点抑制剂抗性的肿瘤疗效的产品中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的产品包括口服药物制剂或食品，所述肿瘤包括结直肠癌。9.权利要求1～6中任意一项所述的益生菌复合制剂联合免疫检查点抑制剂在制备具有ici抗性的肿瘤的药物中的应用。10.权利要求1～6中任意一项所述的益生菌复合制剂在纠正荷瘤小鼠肠道菌的紊乱，改善其多样性和组成中的应用，以及在具有ici抗性的肿瘤模型中的应用。

技术总结

本发明公开了一种具有改善肠道微生态性能和增强肿瘤免疫检查点抑制剂效果的益生菌复合制剂及应用。本发明的益生菌复合制剂包括有婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌三大类益生菌，同时还添加了低聚果胶益生元。本发明通过动物实验表明，该益生菌组合物能够纠正荷瘤小鼠肠道菌的紊乱，改善其菌多样性和组成，该益生菌组合物联合检查点抑制剂PD-1抑制剂能够显著增强直肠癌小鼠模型的疗效；该益生菌组合物各菌种之间相互作用，协同增效，能够有效调节肠道菌、改善机体免疫状态、提高肿瘤的免疫检查点抑制剂效应，且对正常组织器官无不良影响，为肿瘤的免疫提供了新的策略和思路。提供了新的策略和思路。提供了新的策略和思路。