第一节体细胞胚胎发生特点及方式
一、体细胞胚胎发生特点鞋帮
植物胚胎发生（Somatic embryogenesis）从合子开始。自20世纪50年代末Steward等发现胡萝卜根细胞离体培养可通过体细胞胚胎发生形成再生植株以来，大量研究表明，大多数植物组织培养、单细胞悬浮培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚胎发生或花粉胚胎发生。其中体细胞胚为二倍体的体细胞产生的胚状结构；而花粉胚（Pollen embryos）是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的体细胞胚，可发育成单倍体植株。 体细胞胚或花粉胚都起源于植物组织培养中一个非合子细胞，是经过胚胎发生和胚胎发育过程而形成的胚状结构。体细胞胚是离体诱导过程中组织培养的产物，与无融合生殖胚明显不同，只限于组织培养范围使用；体细胞胚起源于非合子细胞，明显区别于合子胚；体细胞胚的形成经过胚胎发育过程，与组织培养器官发生途径中芽与根的分化不同。
植物体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比具有明显的特点：
①具有两极性：在体细胞胚胎发生早期就具有胚根和胚芽两极性的存在，胚性细胞第一次分裂多为不
均等分裂，形成顶细胞和基细胞，继而由较小的顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，而较大的基细胞经过少数几次分裂成为胚柄部分，在形态上具有明显的极性，发育过程与合子胚相似。体细胞胚一经形成，多数可生长为小植株，成苗率高。因此，常将发育一定时期的体细胞胚制作成人工种子，以达到快速繁殖优良种质的目的。不定芽和不定根则为单极性。
②存在生理隔离：体细胞胚形成后与母体植物或外植体的维管束系统较少连接，出现所谓生理隔离（Physiological isolation）现象，与器官发生途径完全不同（不定根或不定芽往往与愈伤组织的维管组织连接）。
③遗传性相对稳定：体细胞胚是由那些未经过畸变的细胞或变异较小的细胞形成，并可以实现全能性表达，通过体细胞胚形成的再生植株变异小于器官发生途径形成的再生植株。正是基于体细胞胚的基因型与亲本相似，产生的后代植株表型也与亲本基本相同。因此，体细胞胚可以制作成人工种子，不仅加速繁殖，且可保持优良种质的遗传稳定性。器官发生途径再生植株一般要经过脱分化和再分化过程，诱导分化率和成苗率都较低，且芽和根的分化也需在不同条件下诱导，需要时间较长。
熬至滴水成珠④重演受精卵形态发生的特性：植物组织培养形态发生的几种方式中，体细胞胚胎发生途径是最能体现植物细胞全能性的一种方式，因为它不仅表明植物体细胞具有全套遗传信息，而且重演合子形态发生的进程（转引自崔凯荣，戴若兰，2000）。
二、体细胞胚胎发生方式
植物组织培养过程中体细胞胚胎途径可分为直接途径和间接途径两类。直接途径是指直接从原外植体不经愈伤组织阶段发育而成；间接方式是指体细胞胚从愈伤组织或悬浮细胞，有时也从已形成的体细胞胚的一组细胞中发育而成。如香雪兰（Freesia refracta）花序外植体经直接体细胞胚胎发生途径形成再生植株（转引自崔凯荣，戴若兰，2000）。
直接发生体细胞胚胎的来源细胞可以是外植体表皮、亚表皮、幼胚、悬浮培养的细胞和原生质体。一般认为直接方式发生体细胞胚是由原来就存在于外植体中的胚性细胞——预胚胎决定细胞（PEDCs）培养后直接进入胚胎发生而形成体细胞胚（Sharp WR，et al，1980），如柑桔属的珠心组织（体内或离体）可以通过预胚胎决定细胞直接进行体细胞胚的发生（Evans DA和Sharp WR，1981），而且是自然发生，有时甚至不需要借助外源生长调节剂的作用。在体细胞胚再生植株表皮细胞中含有预胚胎决定细胞，可以在合适条件下直接进行体细胞胚胎发生，如胡萝卜和石龙芮等。
在间接体细胞胚发生过程中，起始培养基中生长素或生长素/细胞分裂素的浓度，对启动
已分化细胞恢复有丝分裂活性十分重要，而且对这些细胞成为胚胎发育状态的外遗传的重决定也很重要，之后这些细胞的胚胎发育还必须在诱导培养基上进一步 诱导。
间接体细胞胚胎发生中，外植体已分化的细胞先脱分化，并对进一步发育重新决定而诱导出胚性细胞——诱导胚胎决定细胞（IEDCs ），进而形成体细胞胚。
第二节 体细胞胚胎的起源和发育成植株的能力
一、体细胞胚的起源
体细胞胚胎发生的直接途径和间接途径均存在起源问题，即是起源于单细胞还是多细胞? 迄今为止，一直存在不同的看法，但绝大多数研究都认为体细胞胚胎起源于单细胞。从多种植物中都观察到单个胚性细胞，有不均等分裂的二细胞原胚和均等分裂的二细胞原胚、多细胞原胚、球形胚直到成熟胚。如木豆幼苗叶片愈伤组织悬浮培养体细胞胚的形成起源于单细胞，并且观察到体细胞胚发育的各个时期（见图5.1）。仙人掌科体细胞胚的发育也起源于单细胞（见图5.2）。
a —胚性叶片愈伤组织；
b —球形细胞；
c —伸长细胞；
d —两个细胞时期；
e —四个细胞时期；
f —原胚；
g —球形胚；
h —心形胚；
i —早期胚；
j —成熟胚；k —不同时期的体细胞胚； l —体细胞胚的萌发；m —再生小植株
图5.1 木豆幼苗叶片愈伤组织悬浮培养体细胞胚的发育过程
（引自Anbazhagan and Ganapathi ，1999） a b c d e f g h i j k m
l
a —胚性细胞第一次分裂；
b ～d —原胚第一次细胞分裂，鳄梨树形胚柄细胞仍 保持单个细胞；e —胚柄细胞开始增殖；f ～k —原胚和胚柄
发育的不同时期；l —球形体细胞胚；m —成熟胚 （ep ＝原胚；s ＝胚柄）
图5.2 仙人掌科体细胞胚胎的早期发育（由单细胞形成球形胚时期）
牧草割草机
（引自Rodriguez-Garay and Rubluo ，1992）
在同一块愈伤组织或一个胚性细胞复合体上，可以观察到一个或多个不同发育时期的体细胞胚（见图5.3和图5.4），从单个原始细胞到多细胞的原胚、球形胚、心形胚、胚直至具子叶的胚状体，这是由体细胞胚发生和分裂的不同步所致。王亚馥等在红豆草单细胞悬浮培养中也观察到体细胞胚的形成，单个胚性细胞具有明显极性，第一次分裂多为不等分裂，顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，基细胞进行少数几次分裂形成胚柄。
有的研究观察到体细胞胚来源于多细胞组成的胚性细胞复合体。王亚馥等也观察到这种胚性细胞团，但经同位素脉冲标记证明这些细胞团也是由一个单细胞连续分裂而成，经进一步分化和分裂形成不同发育时期的体细胞胚，因而这些体细胞胚实质上也可能起源于单细胞，当然也不排除有些植物的体细胞胚的确是起源于多细胞。体细胞胚胎的发生是一个非常复杂的生理过程，仍有许多问题需进一步深入研究。
图5.3 香蕉心形体细胞胚 图5.4 可可心形胚A 和球形胚B
（引自Cirad ，2003） （引自Cirad ，2003）
二、体细胞转变为胚性细胞的机制
体细胞胚无论是起源于单细胞还是多细胞，都存在一个共同的问题，即体细胞如何转变为胚性细胞而形成体细胞胚。大量研究表明，植物细胞在一定培养条件下，具体细胞胚胎发生能力可能是一个普遍现象。
植物体细胞胚胎发生实质上是细胞分化的问题，而细胞分化的分子基础则是基因差别表达与调控的结果。有关细胞分化的分子机制有许多理论，其中最具普遍性的是渐变理论，认为一个细胞系的细胞质因子间的互相作用是一个原发稳定基因组中基因活化的结果，从而使该细胞系与其他细胞系不同。这一理论认为细胞分化可以分为两个阶段，第一阶段为A
B
预决定阶段，细胞接受或预决定特殊发育，但并未表现出可见的特化标志，这种特性一旦建立，就可以在细胞继代培养中得以稳定保持；第二阶段是表达阶段，在适宜条件诱导下，体细胞胚发生预决定的细胞（Pro-embryogenic determined cells，PEDC）产生一系列生理生化和形态变化，表现出分化的特性，但由于这种表达与培养过程中诱导因素关系密切，因而表现为一种生理反应，是不稳定的（
韩碧文，1989）。这一理论在某种程度上可以解释体细胞胚发生的细胞学机制，但并未揭示体细胞胚胎发生的实质，以及细胞的预决定性是如何实现的；未能解释经多次继代培养的细胞往往会失去胚胎发生能力，因这一理论认为预决定细胞在以后的培养过程中处于稳定状态；不能解释体细胞胚胎直接发生途径和间接发生途径可因条件不同而相互转化的问题。为了揭示体细胞胚胎发生的实质，应深入研究这些细胞在离体培养条件下细胞分化过程中基因差别表达与调控，克隆与鉴定相关的基因。因此，需建立较为稳定、体细胞胚发生频率高、重复性好、细胞分裂同步化高、可控的相互转化的分化程序，并在形态或生理生化上提供用于鉴定体细胞胚胎发生的准确指标及相应的突变体等的实验体系。
按预决定观点，从外植体组织或细胞直接形成体细胞胚的途径需要一种诱导物的合成或抑制物的消除，以恢复有丝分裂活动和促进胚胎发育。这时生长素对胚胎发生常起抑制作用，去除生长素并给以必要的条件，细胞就可进入分裂周期并进行胚胎发生的表达。而从外植体经过脱分化形成愈伤组织，间接产生体细胞胚的途径，则需要分化细胞的重新预决定，被称为诱导的胚胎预决定的细胞（Induced embroygenically determined cells，IEDC）这时则需要生长素，诱导细胞进入细胞分裂周期。生长素不仅是使细胞发生分裂所必需的物质，而且也是使细胞进入胚胎状态所必需的因素（韩碧文，1989）。
三、体细胞胚发育成植株的能力
一般而言，体细胞胚胎一旦分化出来或甚至完成诱导后，转移到基本培养基上即可发育成熟，并可形成小植株（见图5.5）。陈东方等（1986）对棒头草幼穗培养的研究表明，体细胞胚形成之后，可以在原来培养基或无任何附加成分的MS培养基以及加IAA或NAA 0.5mg/L和6-BA 0.5mg/L的1/2 MS培养基上萌发形成小植株。体细胞胚萌发时，观察到两种不正常萌发现象，一种是不完全萌发，即只有芽而无根或只有根而无芽；另一种是早熟萌发，即在体细胞胚还未表现出完整的胚结构之前就已萌发，萌发时盾片膨大形成叶状体，在叶状体基部长出芽。体细胞胚胎途径的形态发生能力要比器官分化途径保持更长久。
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3
1—茎尖培养诱导形成胚性愈伤组织（MS培养基附加2.0mg/L 2，4-D）；柴油添加剂
2—胚性愈伤组织悬浮培养增殖（MS培养基附加2.0mg/L 2，4-D）；
3—由细胞集合体形成体细胞胚（MS培养基附加2.0mg/L 2，4-D）；
4—体细胞胚萌发并形成小植株（MS培养基附加1.0mg/L ABA）
（比例尺R＝1.0mm）
图5.5 甘薯胚性愈伤组织诱导体细胞胚和再生小植株（品种栗子香）
（引自Liu, et al，1997，1998）
第三节体细胞胚发生生化基础及影响体细胞胚胎发生因素
一、体细胞胚发生的生化基础
近年来，随着植物生物技术的长足发展，人们对植物体细胞胚发生早已不局限于形态学和细胞胚胎学的直观描述，而是在此基础上，紧密结合细胞胚胎学过程研究生理生化机制，探讨体细胞胚发生的分子基础。其中对体细胞胚形成过程中蛋白质和酶的动态变化的研究，为最终揭示体细胞胚发生机制奠定基础。
1. ATP酶活性的提高
研究表明，在枸杞的胚性细胞早期，ATP酶反应产物主要沉积于质膜和液泡膜上，尤其是在质膜上的ATP酶活性高，且呈连续分布。胚性细胞后期，ATP酶活性从细胞质逐渐转入细胞内，在细胞质、液泡和细胞核中均有ATP酶活性反应，进一步表明ATP酶活性在胚性细胞发生过程中形成。胚性细胞后期，细胞内部ATP酶被激活，表明细胞代谢活跃。随着胚性细胞壁的加厚，细胞间隙和细胞壁上ATP酶活性的存在，可能为胚性细胞的分裂和发育提供能量，或者与物质和信息的传递密切相关。
2. 过氧化物酶和其他酶类
体细胞胚发生和发育是大量酶特异性合成及参与代谢的结果。体细胞胚发生和发育过程中具有较高的
过氧化物酶活性和较多的同工酶种类。如过氧化物酶在小麦体细胞胚发生中起
着重要的作用，尤其是C
2、C
6、
C
9
三种同工酶带是胚胎发生的特异性酶带，被称为小麦体细
胞胚发生的标志酶。对大麦形态发生中几种酶的同工酶分析结果发现，过氧化物酶、酯酶和酸性磷酸酶同工酶的结合应用，可以作为体细胞胚发生的标志酶。近年来在枸杞的体细胞胚发生中，发现超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD或POX）和过氧化氢酶（CAT）等几种抗氧化酶的活性在胚胎发生与发育过程中有特异性变化，表明体细胞胚发生也与超氧化物自由基的清除有关。
3. 体细胞胚发生过程中存在活跃的蛋白质合成，为体细胞胚发生和发育奠定分子
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基础
有关体细胞胚发生中可溶性蛋白质含量的变化已有大量研究报道，尽管有些结果不尽相同，但变化趋势相近。在各类材料中，胚性愈伤组织的可溶性蛋白质含量和合成速率远高于非胚性愈伤组织，表明前者代谢活性高于后者。
4. 体细胞胚发生中特异胚性蛋白质的形成
体细胞胚发生中不仅有蛋白质含量的变化，而且有特异的胚性蛋白质形成，推测这些胚性蛋白既可作为调控因子，又可作为结构蛋白、贮藏蛋白和酶蛋白而起作用。20世纪80年代，在胡萝卜、水稻、玉米和豌豆等植物体细胞胚发生的研究中，发现有特异性蛋白质形成，而且在这些材料的胚性愈伤组织中，都存在45～55 kDa 的胚胎发生特异性蛋白质的合成。在苜蓿体细胞胚发生中，发现有50kDa 特异性膜蛋白质表达，并作为苜蓿体细胞胚发生的分子标志（转引自崔凯荣，戴若兰，2000）。
5. RNA代谢动态
RNA的合成是胚性细胞发生的分子基础，也是体细胞胚正常发育的重要条件。在体细胞胚发生和发育过程中，不仅RNA合成速率远高于非胚性愈伤组织，而且不同发育时期mRNA 种类不同，进而翻译形成多种蛋白质。此外，这些种类丰富的mRNA的cDNA文库是研究胚胎发生与发育分子机制有效的分子探针。Sengupta等在20世纪80年代初研究发现，胡萝卜
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