中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology2021,43(1): 134-143DOI: 10.11844/cjcb.2021.01.0017 助勃器
何其邹洪>，2鄂一岚K2王广超张贵芳1林金星李瑞丽
G北京林业大学林木分子设计育种高精尖创新中心，北京100083;
2北京林业大学生物科学与技术学院，林木育种国家工程实验室，北京100083)
摘要 细胞壁作为植物细胞重要的组成部分，在决定细胞形状、维持机械支撑、吸收养分等方面发挥重要功能。因此，揭示植物细胞壁合成的调控机制具有重大的生物学意义。基于植物组
织水平研究细胞壁的生物合成具有难以控制时间尺度、观察空间狭小等局限性。原生质体作为去
除细胞壁的单个细胞是研究细胞壁再生的理想系统。在过去的几十年里报道了大量关于植物原生
质体再生细胞壁的研究，但是关于细胞壁再生的机制尚不清楚。该综述介绍了目前应用于植物原
生质体再生细胞壁研究的主要技术和取得的研究进展，并且对该领域的后续发展进行了展望，为进
一步阐明植物细胞壁生物合成的机制提供理论参考。
关键词植物；细胞壁再生；原生质体；细胞壁成像；原生质体培养 Cell Wall Regeneration of Plant Protoplast
H E Q iz o u h o n g12, E Y ila n1,2, W A N G G u an gch ao12, Z H A N G G u ifa n g1, L IN J in x in g1,2, LI R u ili1,2**
Beijing Advanced Innovation Center f or Tree Breeding by Molecular Design, Beijing J 00083, China; 2National Engineering Laboratory f or Tree Breeding, College o f B iological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)
Abstract C ell w all, as a significant com ponent o f plant cell, is essen tial for determ ining cell shape, m aintaining m echanical support, and absorbing nutrients o f plants. Thus, it is o f great b iological significance to reveal the regulatory m echan ism o f plant cell w all biosynth esis. Studying cell w all b iosyn th esis based on organizational lev els has great lim itations in term s o f controlling the tim e scale and narrow observation space. Protoplast is an ideal m odel sy stem for studying cell w all regeneration w ith cell w all rem oved. O ver the past few d ecad es, a large num ber o f studies
o n cell w all regeneration from plant protoplast h ave been reported. H o w ev er the m echanism u nderlying this proce ss is yet unclear. T his rev iew introduces the primary techniques and research progresses applied to the study o f plant ce ll w all regeneration in protoplast and u n veils a p rospective advances o f this field, providing theoretical reference for further clarifyin g the m echan ism o f cell w all biosynthesis.
K e y w o r d s plant; ce ll w all regeneration; protoplast; c e ll w a ll im agin g; protoplast culture
植物的细胞壁是其区别于动物细胞所具有的 以及响应生物和非生物胁迫等方面发挥重要的生 特征结构之一，其组成和动态结构在决定细胞形物学功能[1]。在《科学》杂志创刊125周年纪念刊中，状、维持植物生长过程中的机械支撑、吸收养分 植物如何形成细胞壁被列为未来25年要解决的重大
收稿日期:2020-07-29 接受日期:2020-10-09
国家自然科学基金(批准号:31970182、31670182、31530084、31761133009)、中央高校基本科研业务费专项(批准号:2019ZY29)和国家重点研发计划(批准号: 2016 Y FD0600丨02)资助的课题
*通讯作者。Tel: 134****0885,**********************
Received: July 29, 2020 Accepted: October 9,2020
stc2052
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No.31970182, 31670182, 31530084, 31761133009), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (Grant N〇.2019ZY29) and the National Key Research and Development Program of C hina (Grant N〇.2016YFD0600102)
♦Correspondingauthor.Tel:+86-134********,E-mail:****************
URL: /arts.asp?id=5436
何其邹洪等：植物原生质体的细胞壁再生135
科学问题之一。因此，阐明植物细胞壁的形成机理 是一项亟待解决的科学问题。传统的基于植物组织 水平的研宄方法在表征细胞壁的发生、再生过程的 动态变化等方面具有局限性。C O C K I N G121于1960 年首次报道了采用酶解法去除细胞壁得到大量原生 质体的方法，为研究细胞壁再生创造了条件。从植 物组织或者悬浮细胞中.酶解得到的原生质体具备再 生细胞壁的能力，是研究细胞壁再生的理想材料。早在上世纪50—60年代，B A C H M A N!''^131就利用真 菌原生质体进行再生细胞壁的研宄，P O J N A I^[41实 现了番茄薄壁组织原生质体细胞壁再生的实验。此 后，涌现出一大批以原生质体为材料进行细胞壁再 生的研宄。本文总结了近几十年来报道的关于植物 原生质体细胞壁再生的研宄，从原生质体分离与培 养、细胞壁再生过程成像技术、细胞壁组分检测技 术、细胞壁再生分子机
制研宄几个方面作简要综述。
1植物细胞原生质体分离与培养
1.1原生质体分离
制备高质量的原生质体是研宄植物原生质体细胞壁再生关键的一步。原生质体分离可以通 过机械的方法和酶解的方法实现。早在1892年, K L E R C K E R[51就采用机械的方法在细胞质壁分离后 通过切割细胞壁分离出藻类的原生质体，机械的分 离方法对操作手法的要求高且分离的通量低。1960 年，英国的C O C K I N G™首次采用酶解法分离得到了 大量具备高活性的植物原生质体；在1972年，R O N A 等[61用木本植物欧亚槭悬浮培
养细胞作为酶解材料，建立了第一个木本植物原生 质体分离体系。此后，大量研宄者对酶解体系、酶 解条件等进行探索，使酶解法得以快速发展。时至 今曰，酶解法仍然是一种最常用的分离植物细胞原 生质体的方法^
1.2原生质体培养方法
分离得到原生质体后，需要将原生质体置于合 适的培养体系中，原生质体只有在适宜的环境中才 能正常生长，从而完成细胞壁从头再生。目前比较 常用的植物原生质体培养方法分为：液体培养和固
定培养。而液体培养和固定培养具体又可以分为液 体浅层静置培养、固定培养、固-液结合培养、琼 脂糖念珠培养以及看护培养等方法。液体浅层静置 培养是相对简单的原生质体培养方法，仅需要用合适的液体培养基将原生质体稀释成细胞悬液后静置 培养即可。液体浅层静置培养的方法适用范围较广，P A R K等m对比了多种原生质体培养方法对白 杨(Popw/ws m'gra x p原生质体培养的
效果后，发现液体浅层静置培养的方法最适宜 白杨原生质体的生长。液体浅层静置培养具有操作 简便、易于随时添加新鲜培养基等优点，但是同时 存在培养基水分散失、细胞间发生黏连等缺陷。相 较于液体浅层静置培养，固定培养的操作相对繁琐。固定培养最早由N A G八丁八等[81应用在烟草叶肉原生 质体培养中，将原生质体悬液与溶胶状态的琼脂混 合后平铺在培养皿上，待琼脂凝固后原生质体镶嵌 在固体培养基中，实现原生质体的固定培养。固定 培养的一个显著优点是培养基的更新比较方便[9]。固-液结合培养与液体静置培养相似，在液体培养基 的下层添加一层含有琼脂的固体培养基，底层的固 体培养基具有吸收细胞代谢物、向液体培养基释放 营养物质等作用琼脂糖念珠培养可以分类到固- 液结合培养中，具体方法是将原生质体悬液与液体 状态的琼脂以合适的比例混合后以液滴的形式加入 到液体培养基中，包裹着原生质体的琼脂糖以念珠 的形式存在于液体培养基中，T H O M P S O N等[||]利用 该方法实现了水稻悬浮细胞原生质体的培养。看护 培养是通过在培养基的底部添加一层灭活的原生质 体作为滋养层，采用纤维素膜将滋养层与培养的细 胞分隔开的方式，W A N G等〜通过看护培养方法研 宄青桐(Mw s a a c w m/natocv)原生质体再生植株的过 程。各种原生质体的培养方法总结如表1所示。
1.3原生质体培养的影响因素
原生质体再生细胞壁涉及到复杂的代谢调控 过程，对于原生质体培养的条件要求比较高，细胞壁 再生受到原生质体的密度、培养液渗透压、培养基 的类型、外源添加物(例如植物激素、小分子化合 物)、培养条件等多种因素的影响。
1.3.1初植密度 原生质体培养的初植密度对其
正常生长尤为重要，密度过高或者过低均不适宜原 生质体的生长：密度过大则细胞间对营养物质、氧 气的竞争大；密度过小则不利于原生质体的生长。目前，大多数关于原生质体培养的研宂表明，比较 理想的原生质体培养密度为10M06个/m L。K O-B A Y A S H I等[23]关于甜橙细郎也O s b.)原生质 体培养的研究显示，初始培养密度为4x l〇4个/m L 时，
136.综述.
表1几种常用原生质体培养方法比较
Table 1 C om parison of several commonly used protoplast culture m ethods
培养方法优点缺点适用植物
Culture methods Advantages Disadvantages Applicable plants
Liquid culture Simple operation, convenient to add
fresh medium The water in the culture medium
is easily lost and adhesion occurs
between cells
hybrid pop\aT(Populus nigra x P. maximow-中渔网
iczii)l7\ Gossypium hirsutum L.[13), Robinia
pseudoacacia L.[141, Ipomoea cairica L.[,sl
Liquid over solid culture The bottom solid medium can absorb
cell metabolites and release nutrients
to the liquid medium
减速机测试台
Complex operation Gossypium davidsoni^6]
Agarose droplets Avoiding cell adhesion, convenient The experiment process is Oryza sativa Ulmus minor Mill.117*, culture supply of nutrients complicated Spathiphyllum and Anthurium[l81, C. sinen
s is^
Solid culture Convenient medium replacement;
大规模定制easy to track the growth status of
specific cells It is difficult to remove cell metabo
lites
Brassica oleraceavar botrytis[20\ Echinacea
purpurea^
Liquid, feeder layer culture Feeder layer may provide growth
factors for cultured cells
The operation is difficult and the
experimental steps are complicated
Musa nana Lour.1223
最适合原生质体生长，密度过高或过低均影响原生 质体的正常生长。
1.3.2渗透压 培养液的渗透压也是影响原生质 体再生壁的一个重要指标，渗透压过高原生质体会 皱缩停止生长，渗透压过低原生质体则直接吸水胀 破。渗透压的调整不能只考虑渗透压的大小，不同 的物种对于渗透剂也有不同的要求。例如，在小构 树(5r〇M M〇«e?/a Sieb)叶肉原生质体再生植 株的研究中，O K A等％发现，当使用蔗糖或果糖作为 渗透剂时，细胞发生多次分裂，但子细胞细胞质贫乏 且没有淀粉积累，最终停止分裂；相比之下，葡萄糖 作为渗透剂可以诱导细胞持续分裂。
1.3.3培养基类型 培养基为原生质体再生细胞壁 提供必需的营养物，目前市场上常见的用于组织培 养的基本培养基大部分可以用来培养原生质体，大 量关于原生质体再生的研宂表明，M S培养基m、B5 基本培养基岡、W P M培养基、K M8P培养基[27】等均 可应用于植物原生质体培养，其中，K M8P培养基富 含有机物且营养丰富，广泛应用于植物原生质体培 养。但是不同的物种对于基本培养基也有一定的偏 好性，例如木本植物原生质体培养比较偏向于使用 M S培养基和W P M培养基。总之，培养基的选择需 要根据所选择的培养材料的特性进行摸索。
1.3.4外源补充物 研宄表明，在原生质体培养体 系中加入一些外源补充物有助于原生质体的生长与 分裂。植物激素是原生质体从头再生细胞壁首要考虑的因素之一，大部分植物原生质体培养都需要添 加外源激素。生长素和细胞分裂素是两种在植物细 胞培养中被使用最多的激素，大量研究表明生长素 和细胞分裂素在启动细胞壁的再生过程中发挥重要 作用[2M2]。在胡萝卜[281和大豆—的原生质体培养中，外源生长素的加入是保证原生质体正常生长的必要 条件。T A K E U C H I D等发现，在培养长春花 raxea)原生质体时，如果缺少生长素2,4-D，原生质体 再生细胞壁的效率显著下降。然而11011河1丫人等[31]培养烟草原生质体的实验结果与前者相反，U C H I-M I Y A的结果表明，生长素在烟草原生质体培养中 并不能发挥促进作用。关于细胞分裂素在原生质 体培养中的作用，T A O等％发现，在烟草原生质体 培养体系中加入细胞分裂素B A，原生质体会发生出 芽的现象；U C H I M I Y A等1311的研究也表明，在含有 激动素的培养基中，烟草原生质体再生细胞壁的效 率高达85%；有关细胞分裂素促进原生质体再生细 胞壁的机制目前尚不清楚。此外，脱落酸对原生质 体的生长也有影响，（：0〇<^6等[331和B A L S E V I C H 等[341的研究均表明，脱落酸对原生质体的生长具有 一定程度的抑制作用，但是，1108£11丁5[35]在培养烟 草保卫细胞原生质体的实验中发现，低浓度的脱落 酸(0.1~1.0 p m o l/L)可以提高原生质体的存活率。
除了植物激素，近些年的研究表明，肽类生 长调节物质和糖类也对原生质体培养具有促进作 用。在甜菜(5eza vw/gani L.)叶肉原生质体培养的
何其邹洪等：植物原生质体的细胞壁再生137
研究中，G R Z E B E L U S等网发现，向培养体系中添加 10 nmol/L植物磺肽素可以大大增加原生质体的植板 率。半乳糖葡甘露寡糖是一种植物细胞伸长和分化 的信号分子，其对原生质体的活力和再生有促进作 用137]。在高等植物中，多胺参与多种生长发育过程，细胞内多胺水平和代谢可能与植物原生质体的全能 性表达有关[9]。1^尺03丫等[381提出，亚精胺促进原 生质体生长并刺激有丝分裂。
因为植物细胞本身就能合成内源激素和生长 调节因子，所以外源添加物在原生质体培养中的应 用没有统一的标准，对于外源激素的需求需要同其 内源激素的合成情况相结合，不同的植物材料对外 源植物激素的种类及浓度的需求差别很大。利用液 相谱-高分辨质谱联用(liquid chromatography-high resolution mass spectrometry,L C-H R M S)、液相谱- 串联质谱（liquid chromatography with tandem ma s s spectrometry,L C M S/M S)等技术测定原生质体不同 再生阶段释放多种体内激素或调节因子的水平，可 以为原生质体培养研究中外源添加物的选择提供参 考閃。
1.3.5培养条件 适宜的培养条件对原生质体生长和细胞壁的再生具有辅助作用。温度和光照是 两个最基本的指标。原生质体培养的温度控制在 24〜28 °C的范围内比较合适。培养过程是否提供光 照需要根据培养材料而定，一般木本植物的原生质 体培养不需要进行光照，而是采用黒暗培养，因为光 照可能会对细胞膜造成损伤。但是也有一些研宄表 明，在培养过程中，对含有叶绿体的原生质体给予光 照刺激可以提高细胞壁再生效率[6]。
2细胞壁再生过程研究进展
2.1细胞壁再生过程成像研究
近几十年来，细胞壁组分标记技术及各类显微 镜的发展为细胞壁成像研宂奠定了基础，高分辨率 的细胞壁成像技术为揭示细胞壁的发生提供最直观 的证据。电子显微镜和荧光显微镜在细胞壁再生的 成像研究中应用较广。
2.1.1电子显微镜成像 原生质体新形成的细胞壁在普通的光学显微镜下无法被观察到，而电子显 微镜可以直接表征出新生细胞壁的形态特征，在结 合免疫化学技术的基础上还能鉴定新生壁的物质 成分(例如六氨银染多糖)，是一种理想的表征再生细胞壁的工具。通过使用透射电子显微镜，P O-J N A R等W发现，番茄原生质体培养3天后细胞膜表 面就会产生致密物，5天左右产生再生壁。同样利 用透射电子显微镜，吴斯俊等％观察到，小立碗藓
p a f e m)原生质体在培养2天时在细 胞膜上就会有微纤丝的发生，当培养到第4天的时候 微纤丝相互交织形成细胞壁。F O W K E等14(11利用电 子显微镜观察阿米斧原生质体在不
同培养时期细胞壁再生情况，并用六氨银染证实 原生质体新生壁的成分为多糖，结果显示，原生质体 培养2天后细胞表面产生分布不均匀的细小纤维，第 4天时细胞壁成分己经很容易被检测到，并且
部分细 胞开始分裂。黄祥辉等通过对烟草叶肉原生质体的电镜研究发现，原生质体培养1天后细胞内线粒体 的数量明显增加，高尔基囊泡向质膜外分泌内含物，到达第6天时质膜表面出现松散的再生壁，其结果表 明，内质网、高尔基体的活动在细胞壁再生过程中 发挥重要作用。N A G A T A等1421用烟草叶肉原生质体 为材料也得到了与黄祥辉相似的结果，其研究结果 表明：在细胞壁再生的早期(培养35小时后)，细胞膜 表面新生的原纤维是随机排列的，就像穿透质膜出 来的一样；然后新生壁会逐渐增厚并有一定的方向 性；在培养7天后，细胞膜表面形成密集交织的纤维，整个过程如图1所示。利用电子显微镜成像，W I L L I-S O N等1431将番茄原生质体再生细胞壁的过程归纳为 两个阶段：第一个阶段再生壁由一个多片层系统组 成，在细胞膜与新生壁之间具有空隙；在第二个阶段 原生质体通常会在多片层系统下产生一种无定形的 物质用于填充原生质体和质膜之间的空间，直至形 成完整的细胞壁。
2.1.2荧光显微镜成像 电子显微镜成像需要繁琐的制样步骤并且需要将细胞固定杀死，不能实现 活细胞成像。荧光显微镜尤其是激光共聚焦显微 镜的出现为活细胞成像提供条件并被广泛应用到细 胞壁再生成像的研究中。利用荧光成像检测细胞 壁的再生需要将再生壁染，荧光增白剂(calcofluor white,C W)是一类应用较多的细胞壁染料，其可以和 细胞壁纤维素的P-1,4糖苷键特异性结合。早在1970 年,N A G A T A.[441就发现，C W是植物细胞壁的优良 着剂，并且他们用C W染烟草原生质体新生细胞 壁来演示细胞壁再生的过程。[1八》4£等[451的研究 也表明，在原生质体培养体系中加入C W 不会影响原
138.综述.
A：培养16小时后原生质体中质膜(P)表面没有纤维素产生，C hi：叶绿体；B：细胞壁再生的早期阶段(培养35小时后)，质膜表面可见微原纤维(F); C细胞壁再生后期(培养5天后)，微纤丝与质膜平行；D：细胞壁再生成熟期(培养7天后)，细胞膜表面形成密集交织的纤维。
A: no cellulose was produced on the surface of the plasma membrane (P) in the protoplasts after 16 h of cultivation, Chi: chloroplast; B: in the early stage of cell wall regeneration (after 35 h of culture), microfibrils (F) were visible on the plasma membrane surface; C: in the late stage of cell wall re- generation (after 5 days of culture)，the microfibrils were parallel to the plasma membrane; D: at the mature stage of cell wall regeneration (after 7 days of culture), dense interwoven fibers were formed on the surface of cell membrane.
图1烟草原生质体再生壁电镜图(根据参考文献丨42】修改）
Fig.l Electron microscopy of cell wall regenerated from tobacco protoplasts (modified from reference [42])
生质体再生细胞壁，c w是一种理想的细胞壁荧光染 料，下图2为C W染拟南芥原生质体再生壁的荧光 成像图[46]。
为了更详细地研究原生质体再生细胞壁过程 中纤维素微纤丝在再生原生质体中的沉积顺序，R Y U S U K E等％用荧光增白剂染再生细胞壁，然后 利用激光共聚焦显微镜检测微纤丝的再生情况，发 现原生质体在早期表现为纤维素微纤丝的随机排 列，随后微纤丝的排列具有一定的方向性。这暗示, 着有序的纤维素沉积可能决定了原生质体早期极化 和细胞形状。A M S T E L等[48I对烟草原生质体再生细 胞壁进行荧光成像表明，烟草原生质体再生在30分 钟内开始在原生质体表面不同的部位形成微纤丝，随后，具有方向性的纤维素微纤丝开始在细胞表面 沉积，暗示细胞早期极化的开始。
荧光成像除了可以将细胞壁再生过程可视化, 还能定量分析沉积在原生质体表面的纤维素微纤丝。K U K I等％开发了一种定量共聚焦成像方法，用于研宄拟南芥叶肉细胞原生质体的细胞壁再生的动 态过程，一共对3个关键指标(纤维素微纤丝的偏斜 度、纤维素微纤丝总长度和平均角度)进行量化，其 中纤维素微纤丝偏斜度可以反映多条微纤丝成束情 况，微纤丝总长度是衡量纤维素微纤丝沉积扩散的 一个很好的指标，平均角度可以作为细胞伸长的重 要指标。
2.2细胞壁再生过程细胞壁组分检测
细胞壁的组分十分复杂，在体外培养原生质体 再生出来的细胞壁是初生壁，初生壁的主要成分为 纤维素、半纤维素和果胶。纤维素形成的微纤丝嵌 入胶质状的果胶基质、半纤维素和少量蛋白质中。这些细胞壁组分在细胞壁再生的过程中发挥重要的 生物学功能。揭示细胞壁再生过程中新生细胞壁各 化学组分的时空信息有助于更好地阐明细胞壁再生
烷基叔丁基醚
的机制。
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